BCDO2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-413515-ACT

Il gene umano **BCO2** codifica la beta-carotene ossigenasi 2 (BCDO2), un enzima mitocondriale deputato alla scissione dei carotenoidi, che catalizza la scissione ossidativa dei carotenoidi e dei relativi apocarotenoidi, influenzando così l’equilibrio cellulare dei retinoidi e l’omeostasi antiossidante. Limitando l’accumulo di carotenoidi nei mitocondri, BCDO2 contribuisce all’integrità mitocondriale, alla regolazione delle specie reattive dell’ossigeno e alle risposte allo stress metabolico che si intersecano con il metabolismo lipidico e la segnalazione redox. Alterazioni dell’espressione di BCO2 sono state collegate in letteratura a modifiche della segnalazione dipendente da carotenoidi/derivati dei retinoidi e a disfunzione mitocondriale, processi rilevanti per fenotipi metabolici e per patologie tissutali associate allo stress ossidativo. Queste caratteristiche rendono BCO2 un bersaglio utile per studi meccanicistici sul metabolismo dei carotenoidi, sul controllo qualità mitocondriale e su programmi trascrizionali dipendenti dal contesto.

BCDO2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BCO2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BCDO2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BCO2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BCO2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BCDO2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BCO2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BCDO2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BCDO2 nelle cellule tumorali con espressione di BCO2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.