ATP-citrate synthase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403146-ACT

ACLY codifica l’ATP-citrato sintasi, un enzima citosolico che converte citrato e CoA in acetil-CoA e ossalacetato, collegando così il flusso di carbonio mitocondriale alla biosintesi di lipidi e colesterolo. Fornendo acetil-CoA per la sintesi degli acidi grassi e per l’acetilazione delle proteine, ACLY influenza la riprogrammazione metabolica, l’equilibrio redox e la regolazione epigenetica dell’espressione genica. Questo nodo integra segnali provenienti dalla glicolisi, dal ciclo dell’acido citrico (TCA) e dalle vie di sensing dei nutrienti per modulare programmi di proliferazione e differenziamento. Un’attività di ACLY deregolata è stata associata ad alterazioni della lipogenesi e dei profili di acetilazione osservate in contesti di ricerca sulle malattie metaboliche e in oncologia.

ATP-citrate synthase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ACLY senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ATP-citrate synthase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ACLY nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ACLY, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ATP-citrate synthase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ACLY nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ATP-citrate synthase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ATP-citrate synthase nelle cellule tumorali con espressione di ACLY silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.