Atg9b Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406894-ACT

ATG9B umano codifica Atg9b, una proteina transmembrana multipasso che sostiene la biogenesi degli autofagosomi coordinando la consegna di membrane ai siti di formazione degli autofagosomi. ATG9B opera all’interno delle vie centrali della macroautofagia e interagisce con il traffico vescicolare, il controllo di qualità degli organelli e le risposte adattative allo stress che influenzano la proteostasi e il metabolismo cellulare. La disregolazione dell’autofagia e le alterazioni della rete ATG sono state associate alla biologia tumorale, alla neurodegenerazione e ai processi infiammatori, rendendo ATG9B un nodo utile per studi meccanicistici sul flusso autofagico e sulla dinamica delle membrane. Le applicazioni di ricerca includono la mappatura dell’epistasi di via con la segnalazione ULK1–BECN1, lo studio di contesti di autofagia selettiva e il collegamento dell’espressione di ATG9B a fenotipi quali la sopravvivenza in condizioni di stress da carenza di nutrienti.

Atg9b Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATG9B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Atg9b Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATG9B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATG9B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Atg9b. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATG9B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Atg9b nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Atg9b nelle cellule tumorali con espressione di ATG9B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.