Atg3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403308-ACT

L’ATG3 umano codifica Atg3, un enzima di tipo E2 essenziale per l’autofagia, poiché catalizza la lipidazione di LC3/ATG8 e promuove l’allungamento della membrana dell’autofagosoma. Agendo a valle di ATG7, Atg3 supporta la coniugazione di LC3 alla fosfatidiletanolamina e integra segnali legati al sensing dei nutrienti che coordinano la proteostasi, il controllo di qualità degli organelli e l’adattamento allo stress. Una deregolazione dell’autofagia dipendente da ATG3 è stata associata ad alterazioni dell’omeostasi mitocondriale, della segnalazione infiammatoria e dei programmi di sopravvivenza cellulare rilevanti per la biologia del cancro e la neurodegenerazione. In quanto effettore centrale dell’autofagia, ATG3 è spesso studiato per analizzare il flusso della via, i meccanismi di autofagia selettiva e il crosstalk con l’apoptosi e le vie dell’immunità innata.

Atg3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATG3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Atg3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATG3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATG3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Atg3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATG3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Atg3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Atg3 nelle cellule tumorali con espressione di ATG3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.