ASCL1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402039-ACT

ASCL1 (achaete-scute family bHLH transcription factor 1) è un regolatore umano di tipo basic helix-loop-helix che promuove l’impegno verso la linea neuronale e la differenziazione legandosi ai motivi E-box e coordinando programmi genici per la neurogenesi. Agisce all’interno di reti trascrizionali dello sviluppo che integrano la segnalazione Notch, i fattori proneurali e il rimodellamento della cromatina per controllare l’uscita dal ciclo cellulare e la maturazione dei precursori neurali. Un’espressione deregolata di ASCL1 è associata a un’anomala specificazione di linea e a stati di differenziazione neuroendocrina nella biologia del cancro, rendendolo un utile strumento molecolare per studiare la plasticità trascrizionale. Inoltre, ASCL1 è ampiamente utilizzato come marcatore e come driver in modelli di riprogrammazione neuronale e di sviluppo neurale.

ASCL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ASCL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ASCL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ASCL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ASCL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ASCL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ASCL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ASCL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ASCL1 nelle cellule tumorali con espressione di ASCL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.