Arnt 1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419204-ACT

Arnt (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator), noto anche come ARNT1/HIF-1β, codifica un fattore di trascrizione bHLH-PAS che forma eterodimeri con partner quali AHR e HIF-1α per coordinare i programmi genici di risposta agli xenobiotici e di rilevamento dell’ossigeno. Nelle cellule di topo, ARNT integra segnali ambientali e metabolici per regolare reti trascrizionali che controllano la segnalazione angiogenica, il metabolismo glicolitico, l’adattamento mitocondriale e la differenziazione cellulare. Attraverso l’asse AHR/ARNT modula le vie di detossificazione (inclusa l’induzione del citocromo P450), mentre nella via HIF supporta la regolazione trascrizionale in risposta all’ipossia. Una deregolazione della segnalazione dipendente da ARNT è ampiamente utilizzata come punto di ingresso meccanicistico per studiare infiammazione, rimodellamento vascolare e adattamento ipossico associato ai tumori in modelli preclinici, senza implicare esiti clinici.

Arnt 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Arnt senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Arnt 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Arnt nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Arnt, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Arnt 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Arnt nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Arnt 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Arnt 1 nelle cellule tumorali con espressione di Arnt silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.