ARID3A Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-404552-ACT-2

ARID3A umano codifica un fattore di trascrizione legante il DNA contenente un dominio di interazione con sequenze ricche in AT, che regola l’accessibilità della cromatina e programmi di espressione genica coinvolti nella specificazione di linea, in particolare durante lo sviluppo delle cellule B e la regolazione dei geni delle immunoglobuline. ARID3A partecipa a reti di controllo trascrizionale che governano la progressione del ciclo cellulare, la differenziazione e il rimodellamento epigenetico attraverso interazioni con elementi promotori/enhancer e complessi coregolatori. Un’espressione o un’attività disregolata di ARID3A è stata associata a una differenziazione ematopoietica aberrante e a un’alterata segnalazione immunitaria, ed è spesso studiata nel contesto di programmi trascrizionali oncogeni e di firme geniche associate all’autoimmunità. L’editing genetico di ARID3A in cellule umane consente l’analisi meccanicistica delle dipendenze di legame del fattore di trascrizione, della funzione degli enhancer e del riassetto delle vie a valle, utilizzando saggi come RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq e modelli funzionali di differenziazione.

ARID3A Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ARID3A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ARID3A Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ARID3A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ARID3A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ARID3A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ARID3A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ARID3A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ARID3A nelle cellule tumorali con espressione di ARID3A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.