ARHGAP18 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-413983-ACT

ARHGAP18 codifica una proteina attivatrice della GTPasi Rho (RhoGAP) che riduce l’attività della segnalazione della famiglia Rho accelerando l’idrolisi del GTP, contribuendo a regolare il bilanciamento tra GTPasi Rho attive e inattive. Attraverso la modulazione del rimodellamento del citoscheletro, della forma cellulare, dell’adesione e della migrazione, ARHGAP18 partecipa a processi quali la regolazione della barriera endoteliale e la motilità cellulare coordinata. Queste funzioni collegano ARHGAP18 a vie che governano la dinamica dell’actina e l’organizzazione delle giunzioni, rendendolo rilevante per lo studio della biologia vascolare e dei cambiamenti nel comportamento cellulare in risposta allo stress. In sistemi sperimentali, una segnalazione delle GTPasi Rho deregolata e un’alterazione dell’attività o dell’espressione di ARHGAP18 sono state associate a fenotipi pertinenti a infiammazione, migrazione aberrante e invasione cellulare correlata al cancro.

ARHGAP18 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ARHGAP18 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ARHGAP18 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ARHGAP18 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ARHGAP18, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ARHGAP18. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ARHGAP18 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ARHGAP18 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ARHGAP18 nelle cellule tumorali con espressione di ARHGAP18 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.