APPL1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-428481-ACT

Mouse Appl1 codifica APPL1, una proteina adattatrice endosomiale che collega la dinamica degli endosomi precoci Rab5-positivi alla trasduzione del segnale a valle delle tirosin-chinasi recettoriali. APPL1 partecipa alla segnalazione PI3K–AKT, alle risposte a insulina e adiponectina e alla modulazione delle vie associate a MAPK e NF-κB tramite interazioni proteina–proteina che coordinano il traffico intracellulare con gli output trascrizionali. Grazie a questi ruoli, APPL1 è ampiamente rilevante per studi sull’omeostasi metabolica, la sensibilità all’insulina, l’infiammazione e il controllo della crescita cellulare. La deregolazione della segnalazione e dell’instradamento endocitico legati ad APPL1 è stata implicata in modelli di malattia metabolica e di segnalazione proliferativa alterata, rendendo Appl1 un nodo utile per l’interrogazione delle vie di segnalazione in vivo e in cellule coltivate.

APPL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Appl1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

APPL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Appl1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Appl1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di APPL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Appl1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da APPL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via APPL1 nelle cellule tumorali con espressione di Appl1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.