ANO2 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-404198-LAC

L’ANO2 umano codifica l’anoctamina 2 (TMEM16B), un canale del cloruro attivato dal calcio che regola l’eccitabilità di membrana e il flusso di cloruro in risposta a segnali intracellulari di Ca²⁺. L’attività di ANO2 contribuisce alla trasduzione del segnale Ca²⁺-dipendente, modulando la frequenza di scarica dei potenziali d’azione, l’elaborazione dei segnali sensoriali e le dinamiche secretorie in tipi cellulari specializzati. Modificando l’omeostasi ionica e le proprietà elettriche, ANO2 si interseca con vie che governano la segnalazione neuronale e il trasporto epiteliale. Una funzione disregolata dei canali del cloruro è stata associata a fenotipi di eccitabilità alterata ed è rilevante per studi di fisiologia sensoriale e dei meccanismi legati alle canalopatie.

Le particelle di attivazione lentivirale ANO2 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di ANO2 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale ANO2 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione ANO2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di ANO2. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo ANO2 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.