ANO2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-433990-ACT

Ano2 codifica ANO2 (TMEM16B), un canale del cloruro attivato dal calcio che modella l’eccitabilità di membrana accoppiando i segnali intracellulari di Ca2+ al flusso di Cl−. Nei neuroni e negli epiteli sensoriali, ANO2 contribuisce alla ripolarizzazione dipendente dall’attività, all’amplificazione del segnale e all’adattamento della frequenza di scarica, collegando la dinamica del Ca2+ all’omeostasi ionica e all’elaborazione sinaptica. Questo canale partecipa a programmi di trasduzione degli stimoli rilevanti per l’olfatto e per altre vie sensoriali, e un’alterata funzione di ANO2 è stata studiata in contesti di ipereccitabilità neuronale e disfunzione sensoriale. I modelli murini di Ano2 supportano studi meccanicistici su come la conduttanza anionica attivata dal Ca2+ influenzi la fisiologia dei circuiti e la segnalazione cellulare.

ANO2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ano2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ANO2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ano2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ano2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ANO2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ano2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ANO2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ANO2 nelle cellule tumorali con espressione di Ano2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.