ANAPC2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404962-ACT

L’ANAPC2 umano codifica una subunità centrale di impalcatura del complesso promotore dell’anafase/ciclosoma (APC/C), una ligasi E3 dell’ubiquitina multi-subunità che guida la progressione mitotica indirizzando regolatori chiave del ciclo cellulare verso la degradazione proteasomiale. Attraverso l’ubiquitinazione coordinata di substrati quali securina e cicline, l’APC/C controlla la transizione da metafase ad anafase, l’uscita dalla mitosi e il mantenimento della stabilità genomica. La funzione di ANAPC2 si interseca con la segnalazione del checkpoint di assemblaggio del fuso e con la proteostasi dipendente dall’ubiquitina, collegando la tempistica del ciclo cellulare a una corretta segregazione dei cromosomi. La disregolazione dei componenti dell’APC/C, incluse le perturbazioni della rete associata ad ANAPC2, è spesso studiata nel contesto di aneuploidia, stress replicativo e meccanismi di malattie proliferative rilevanti per la biologia del cancro.

ANAPC2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ANAPC2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ANAPC2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ANAPC2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ANAPC2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ANAPC2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ANAPC2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ANAPC2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ANAPC2 nelle cellule tumorali con espressione di ANAPC2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.