alpha-L-iduronidase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403722-ACT

IDUA codifica per l’alfa-L-iduronidasi, un’idrolasi lisosomiale necessaria per la degradazione graduale dei glicosaminoglicani eparan solfato e dermatan solfato. Sostenendo il catabolismo lisosomiale e le vie cellulari di smaltimento, IDUA contribuisce al turnover dei proteoglicani e all’omeostasi complessiva dei lisosomi. Una ridotta attività di IDUA è associata all’accumulo di glicosaminoglicani e a risposte di stress cellulare a valle, comunemente studiate nel contesto della biologia delle malattie da accumulo lisosomiale. Di conseguenza, IDUA è spesso utilizzato come strumento molecolare per interrogare metabolismo, traffico e riciclo delle macromolecole dipendenti dai lisosomi in sistemi cellulari umani.

alpha-L-iduronidase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di IDUA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

alpha-L-iduronidase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus IDUA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione IDUA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di alpha-L-iduronidase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus IDUA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da alpha-L-iduronidase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via alpha-L-iduronidase nelle cellule tumorali con espressione di IDUA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.