AFX1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402408-ACT

Il gene umano **FOXO4** codifica il fattore di trascrizione forkhead box O **AFX1**, un regolatore sensibile allo stress che integra la segnalazione **insulina/IGF-1–PI3K–AKT** con programmi che controllano l’arresto del ciclo cellulare, la resistenza allo stress ossidativo, il metabolismo e l’apoptosi. L’attività di AFX1 è modulata dallo shuttling nucleo–citoplasma dipendente dalla fosforilazione e dal cross-talk con le vie **MAPK** e **JNK**, plasmando output trascrizionali legati all’omeostasi cellulare. Attraverso la regolazione di geni bersaglio coinvolti nelle risposte al danno al DNA e nell’equilibrio redox, FOXO4 contribuisce a fenotipi associati alla senescenza e ai processi di invecchiamento tissutale. Una segnalazione FOXO4/AFX1 disregolata è stata associata al rimodellamento di vie oncogene e a una tolleranza allo stress alterata in molteplici contesti patologici, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici del controllo trascrizionale.

AFX1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FOXO4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AFX1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FOXO4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FOXO4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AFX1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FOXO4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AFX1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AFX1 nelle cellule tumorali con espressione di FOXO4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.