AFX1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402408-ACT

Das humane FOXO4-Gen kodiert den Forkhead-Box-O-Transkriptionsfaktor AFX1, einen stressresponsiven Regulator, der die Insulin/IGF-1–PI3K–AKT-Signalübertragung mit Programmen zur Kontrolle von Zellzyklusarrest, Resistenz gegen oxidativen Stress, Stoffwechsel und Apoptose integriert. Die Aktivität von AFX1 wird durch phosphorylierungsabhängiges Shuttling zwischen Zellkern und Zytoplasma sowie durch Crosstalk mit MAPK- und JNK-Signalwegen moduliert, wodurch transkriptionelle Outputs im Zusammenhang mit der zellulären Homöostase geprägt werden. Durch die Regulation von Zielgenen, die an DNA-Schadensantworten und der Redox-Balance beteiligt sind, trägt FOXO4 zu seneszenzassoziierten Phänotypen und Prozessen der Gewebealterung bei. Eine dysregulierte FOXO4/AFX1-Signalgebung wurde in mehreren Krankheitskontexten mit einem Remodeling onkogener Signalwege und einer veränderten Stresstoleranz in Verbindung gebracht, was FOXO4 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien zur transkriptionellen Kontrolle macht.

AFX1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FOXO4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AFX1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FOXO4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FOXO4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AFX1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FOXO4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AFX1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AFX1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FOXO4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.