ABCG5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402729-ACT

ABCG5 codifica un trasportatore della famiglia ATP-binding cassette (ABC) che forma un eterodimero con ABCG8 per mediare l’efflusso di steroli attraverso la membrana apicale degli enterociti e la membrana canalicolare degli epatociti. Questo complesso di trasporto limita l’assorbimento intestinale degli steroli alimentari e promuove la secrezione biliare di colesterolo e steroli vegetali, contribuendo all’omeostasi lipidica dell’intero organismo. L’attività di ABCG5 è integrata con le vie epatiche e intestinali di gestione degli steroli, inclusi i programmi trascrizionali regolati da LXR e il metabolismo degli acidi biliari. La disfunzione genetica o la ridotta espressione di ABCG5 è associata a fenotipi di accumulo di steroli, come la sitosterolemia, e può influenzare modelli di ricerca correlati alla dislipidemia.

ABCG5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ABCG5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ABCG5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ABCG5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ABCG5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ABCG5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ABCG5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ABCG5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ABCG5 nelle cellule tumorali con espressione di ABCG5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.