μ-protocadherin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406015-ACT

CDHR5 codifica la μ-protocaderina, una molecola di adesione cellula-cellula calcio-dipendente arricchita nei tessuti epiteliali polarizzati, dove contribuisce all’organizzazione delle giunzioni e al mantenimento dell’architettura apico-basale. Modulando i contatti adesivi e l’accoppiamento con il citoscheletro, la μ-protocaderina influenza i programmi di differenziamento epiteliale e i processi legati alla barriera che modellano l’omeostasi tissutale. Un’alterata espressione di CDHR5 è stata associata a una compromissione dell’integrità epiteliale e a fenotipi di rimodellamento rilevanti per la trasformazione oncogenica, i cambiamenti associati all’invasione e altre patobiologie epiteliali. In quanto marcatore epiteliale con ruoli funzionali alle interfacce cellulari, CDHR5 è frequentemente esaminato in studi sulla segnalazione dipendente dall’adesione e sulle transizioni di stato epiteliale.

μ-protocadherin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDHR5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

μ-protocadherin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDHR5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDHR5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di μ-protocadherin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDHR5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da μ-protocadherin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via μ-protocadherin nelle cellule tumorali con espressione di CDHR5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.