CRISPR Systems

Santa Cruz Biotechnology now offers target-specific CRISPR/Cas9 Knockout (KO) Plasmids, CRISPR Double Nickase Plasmids, CRISPR/ dCas9 Activation Plasmids and CRISPR Lenti Activation Systems for over 18,910 human and 18,340 mouse protein encoding genes.

CRISPR/Cas9 역사

CRISPR/Cas시스템은 Archea와 박테리아의 고유 면역보호 시스템이 외부 유전물질을 분쇄하는 원리를 이용한시스템이다. 이런 유기체들은 살균바이러스의 외부유전물질을 획득하여 CRISPR loci (1,2)에 통합시킨다. 이 소재는 spacer로도 얄려져 있으며 sequence-specific fragment를 만들어 미래의 살균바이러스의 감염에 대항한다. 이런 sequence-specific fragments는 short CRISPR RNAs (crRNAs)로 번역되여 외부침입상보DNA의 직접적인 cleavage를 가이드하는데 이역시 CRISPR loci (1,2)로 encod된 CRISPR-associated (Cas) 프로틴의 뉴클리아제활성을 통해 완성되고 있다. Cas9뉴클리아제는 type II CRISPR시스템으로서 RNA바인딩구역, alpha helix recognition lobe (REC), DNA cleavage를 위한 RuvC 와 HNH 를 포함한 nuclease lobe 와 protospacer adjacent motif (PAM) 상호작용 사이트 (1,2)를 포함하고있다. crRNA는 REC lobe내부의 bridge helix와 결합하여 Cas9뉴클리아제와 복합물을 형성하며 crRNA (1,2,3)의 backbone와 멀티플 염다리를 형성합니다.

crRNA가 Cas9와 결합하면 Cas9 nuclease의 conformation이 변화하여 DNA바인딩 채널(1,2,3)을 만듭니다. Cas9/crRNA복합물은 DNA의 PAM (5'-NGG) 사이트를 (4,5,6) 스캔해냅니다. PAM s사이트의 인지는 DNA의 unwinding하여 crRNA 가 PAM사이트 주변의 complementary DNA을 체크하도록 리드합니다. Cas9가 PAM site주변의crRNA와 상보적인 DNA sequence와 바인딩하면, REC lobe내부의 bridge helix가 target DNA (3,4,7)와 RNA-DNA heteroduplex를 이루게 됩니다. PAM사이트 인지는 타깃 DNA의 double-stranded break (DSB)를 초래하는 nucleolytic HNH and RuvC domains의 activating에 참여해 DNA degradation (1,2,5,8)을 리드합니다. crRNA와 상보적이지 않을경우 Cas9 는 풀려나와 다른 PAM사이트를 찾게 됩니다(7). 타깃 유전자의 DNA 사슬이 끊기면 nonhomologous end-joining (NHEJ) repair pathway를 통해 복구되는데 이는 삽입이나 삭제를 초래하여 오류가 발생합니다, 반면 homologous directed repair (HDR) pathway를 통해 복구할경우, 유전자의 특정위치에 selected markers를 재결합시킵니다 (2,9,10). CRISPR/Cas9 mechanism은 포유류 세포를 포함한 여러시스템의 genomic engineering에 널리 사용될수있습니다.

DSBs를 형성하는 유전자 교정은 징크핑거뉴클리아제 (ZFN), 탈렌(TALENs) 등 DNA 인지 가능한 메가뉴클리아제로 진행하지만 모두 제한성을 보이고 있습니다. 메가뉴클리아제를 사용할시 뉴클리아제와 DNA사이의 특정된 위치의 인지가 어렵습니다(2). 이외에 징크핑거뉴클리아제와 탈렌은 디자인이 어려우며 3nt의 DNA를 인지하기 어렵습니다 (2). 싱글가이드 RNA (sgRNAs)는 crRNAs와 같이 디자인이 쉬우며 Cas9 뉴클리아제와 같은 벡터로 발현하여 타깃 유전자 교정을 진행할수 있습니다. CRISPR/Cas 9 시스템은 민감성이 뛰여나며 심사시 small hairpin RNAs보다 유효성이 뛰여납니다.

CRISPR/Cas9 시스템의 중요한 이점은 게놈 DNA에 유도하는 DSB의 높은 효율에 있습니다. 이 효율은 off-target의 영향을 받아 CRISPR/Cas9의 편집특이성을 감소시킬수 있습니다. 이 특이성은 CRISPR double nickase system으로 향상가능한데 이는 한쌍의 plasmid로 제공하고 있으며 매 plasmid마다 Cas9 (D10A) nickase mutant (Cas9n)를 인코딩하며 target-specific guide RNA (12)에 의하며 타깃의 특정구역에 유도됩니다. 매개의 Cas9n/sgRNA complex는 guide RNA (12)의 상보DNA strand에 단하나의 nick를 발생합니다. 매개의 guide RNA는 약 20bp가량 떨어진거리에서 opposite strands의 타깃sequence를 식별합니다. 한쌍의Cas9n/sgRNA complexes가 편집한 더블nick는 DSB를 모방합니다(12). 이처럼 한쌍의 guide RNA를 이용하여 Cas9(매개)유전자 편집의 특이성을 증가함과 동시에 높은 효율을 유지합니다 (12).

뿐만아니라 지놈편집에는 CRISPR system으로 내인성유전자(endogenous gene)의 활성화 강화를 실현할수 있습니다(13). CRISPR system을 부분적으로 개조하여 synergistic activation mediator (SAM) complex를 형성하면 고효율적인 specific transcription activation system (13)을 얻을수 있습니다. Cas9뉴클리아제를 개조하여 SAM complex의 한부분을 만듭니다. Cas9의 the catalytic domains을 deactivated시켜 dCas9을 얻어 transcription activation domain (VP64)과 융합시킵니다. target specific guide RNA (sgRNA)로 유도된 dCas9-VP64-sgRNA complex는 내인성유전자의 Transcriptional Start Site (TSS) 의 -200 bp region에 타깃을 맞추어 유전자발현을 upregulate합니다(13). To further enhance transcription, the sgRNA has been modified by appending a minimal hairpin aptamer to the tetraloop and stem loop 2 (13). 이 앱타머는 선택적으로dimerized MS2 bacteriophage coat proteins을 바인딩합니다 (13). MS2 프로틴에 p65 와 HSF1 transactivation domains을 융합하면 MS2-P65-HSF1 fusion protein을 형성하는데 이는 transcription factors를 불러드리는 반응을 강화하여dCas9-mediated gene activation 효율을 증가합니다(13). Activation제품은 모든 cell타입의SAM Transcription Activation System 의 delivery효율보장을 위하여 위한형질주입가능한 standard plasmid와 형질도입가능한 plasmid가 packing된 lentiviral제품을 제공합니다.

Santa Cruz Biotechnology, Inc.에서 CRISP/Cas9 Products 제품들을 제공합니다.

CRISPR/Cas9 Plasmids

CRISPR/Cas9 Plasmid product details:

  • 20 µg, 20 transfections
  • CRISPR/Cas9 Knockout (KO) Plasmids는 Cas9 nuclease 와 특정된 타깃의 고효율 knockout을 위해 디자인된 20 nt guide RNA (gRNA)을 포함하고있습니다.
  • gRNA sequences는 GeCKO (v2) library에서 찾을수 있으며 직접 Cas9 프로틴을 유도하여 유전자 DNA의(11) 특정된 위치에서 double strand break (DSB)를 완성할수있습니다.
  • CRISPR/Cas9 KO Plasmids 는 human 과 mouse 샘플에 제공하고있으며 (h) 나 (m) 로 카탈로그에 표기합니다. 예: p53 CRISPR/Cas9 KO Plasmids (h) for human or p53 CRISPR/Cas9 KO Plasmids (m) for mouse
  • Transfection-ready purified plasmid DNA로 제공됩니다.

Support Products for CRISPR/Cas9 Plasmids:

  • control antibody
  • Ultracruz Transfection Reagent, sc-395739
  • Plasmid Transfection Medium, sc-108062
  • Control CRISPR/Cas9 Plasmid, sc-418922
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CRISPR/Cas9 Plasmids 메커니즘

Download CRISPR / Cas9 Protocols

HDR Plasmid

HDR Plasmid description:

  • HDR plasmids provide a specific DNA repair template for a DSB, and are only used when co-transfected with CRISPR/Cas9 KO Plasmids.
  • CRISPR/ Cas9 KO Plasmid와 co-transfect할시 HDR Plasmid는 Puromycin resistance gene을 통합하여 Cas9-induced DNA cleavage가 완성된 cells을 선정합니다.

HDR Plasmid product details:

  • 20 µg, 20 transfections
  • 특정타깃의 HDR Plasmids는 같은 species, 같은 타깃유전자의 CRISPR/Cas9 KO Plasmid와 co-transfection하는것을 권장합니다
  • HDR Plasmid 는2-3개의 plasmids를 함유하고 있으며, plasmid마다 하나의 homology-directed DNA repair (HDR) template를 함유하고있으며, 이 위치는 corresponding CRISPR/Cas9 KO Plasmids로 진행된 컷트 위치에 해당됩니다
  • 매 HDR template은 두개의 800 bp homology arms이 디자인되여있어 genomic DNA 주변의 Cas9-induced double strand DNA break site와 결합합니다
  • 매 HDR Plasmid 에는 puromycin resistance gene이 있어 stable knockout (KO) cells을 얻을수있습니다
  • 매 puromycin resistance gene의 양측에는 두개의 LoxP sites 가 디자인되여있으며 Cre vector의 추가가공이 가능합니다
  • 매 HDR Plasmid 마다 RFP 를 포함하고있어 transfection을 시각적으로 확인할수있습니다
  • Transfection-ready purified plasmid DNA로 제공됩니다.

Support Products for HDR Plasmids:

HDR Plasmids 메커니즘

Allelic Expression

배수체 세포는 각 염색체마다 두개의 상동한 복제로서 각각의 유전자를 두개의 복제로 지니고 있습니다. 같은 유전자를 지닌 복제는 똑같을 필요가 없으며 대립형질로 알려지고 있습니다. 또한 같은유전자의 대립형질의 특정된 염색체위치에 위치하고있습니다. 한개체내에서 하나의 형질이 흔히 발현하며 우성으로 야생형을 표현하게됩니다. 변이는 새로운 형질을 만들고 각각의 새로은 형질은 표현형을 변화시키게 됩니다.

이배체세포는 대다수 유전자의 두개의 대립형질을 갖고 있기때문에 각각의 타깃유전자 knockout을 함으로서 동형넉아웃(homozygous knockout) 세포집단을 만들려면 추가적으로 transfection과 selection필요할수 있습니다. CRISPR/Cas9 Knockout Plasmid만 사용할시 NHEJ복구가 발생하며 타깃유전자의 삽입과 삭제 mutation을 초래할수 있습니다. CRISPR/Cas9 Plasmid transfection후 타깃유전자는 두 대립형질에서 knockout (bi-allelic knockout) 이발생할수도 있으나 어떤 세포에서는 하나의 대립형질에서 knockout (mono-allelic knockout)이 발생합니다. CRISPR/Cas9으로 transfection을 한 세포집단에는 bi-allelic 과 mono-allelic knockout 세포가 포함됩니다.

CRISPR/Cas9 Knockout Plasmid로 transfection한후 세포집단중 bi-allelic 이나 mono-allelic knockout이 발생하였는지를 웨스턴블롯으로 확인할수 있습니다. 세포의 단일세포집단을 분리하면 mono-allelic 이나 bi-allelic인 세포줄기를 배양할수 있습니다. 이 세포집단을 가득채우게 배양한후 웨스턴블롯은 어떤 집단이 타깃유전자가 bi-allelic 이나 mono-allelic knockdown 되였는지를 분석할수 있습니다. bi-allelic knockout 된 세포집단은 타깃유전자의 100% knockdown을 나타내며 mono-allelic knockdown된 세포집단은 타깃유전자의 50% knockdown을 나타내게 됩니다.

CRISPR/Cas9 Plasmid와 Homology Directed Repair (HDR) Plasmid를 이용하여 co-transfection에 성공하면 타깃 유전자는 파괴되고 homologous directed repair (HDR)가 일어나게 됩니다. co-transfection후 puromycin resistance 유전자가 삽입된 세포를 선발할수 있습니다. 이렇게 선발된 세포에는 mono-allelic 와 bi-allelic 세포 모두 있습니다. 이때 웨스턴블롯은 어떤 세포집단이 타깃유전자의 bi-allelic knockout인지를 확인하는데 도움이 됩니다.


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Cre Vector

Cre Vector description:

  • Cre Vector는 Cre recombinase을 발현하는데 이는 LoxP사이트 사이의 특정위치 DNA recombination를 촉진하는 bacteriophage p1 효소입니다
  • When the CRISPR/Cas9 Knockout Plasmid is co-transfected with the HDR Plasmid, cells containing the edited DNA can be isolated using the selection marker inserted during homology-directed repair
  • selection후, Cre Vector으로 cell을 transfect시켜 homology-directed repair을 통해 타깃유전물질 (puromycin등)을 절제합니다

Cre Vector product details:

  • 20 µg, 20 transfections
  • Recommended for DNA repair of selected cells successfully edited by CRISPR/Cas9 KO Plasmid and HDR Plasmid
  • Cre Vector 는 CMV promoter로 Cre recombinase를 expression합니다
  • Transfection-ready purified plasmid DNA로 제공됩니다.
  • Cre Vector, sc-418923

Support Products for Cre Vector:

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Cre Vector 메커니즘

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Double Nickase Plasmids

Double Nickase Plasmid product details:

  • 20 µg, 20 transfections
  • Double Nickase Plasmids 는 한쌍의 plasmid를 포함하고 있으며 매개의 plasmid는 D10A 변이된 Cas9뉴클레아제와 특정된 타깃의 고효율 knockout을 위해 디자인된 20 nt guide RNA (gRNA)을 포함하고있으며 이는 CRISPR/Cas9 KO 제품에 비해 특이성이 뛰여납니다.
  • 한쌍의 gRNA는 약 20bp가량 떨어져 있으며 이는 게놈DNA의 Cas9-mediated double nicking을 발생하여 DSB를 모방합니다.
  • 한쌍의 plasmid 중 하나는 selection에 필요한 puromycin-resistance gene을, 다른하나는 형질주입효율을 확인하는 GFP marker를 보유하고있습니다.
  • Double Nickase Plasmids는 human 과 mouse 샘플에 제공하고있으며 (h) 나 (m) 로 카탈로그에 표기합니다. 예: p53 CRISPR/Cas9 Double Nickase Plasmids (h) for human or p53 CRISPR/Cas9 Double Nickase Plasmids (m) for mouse
  • Transfection-ready purified plasmid DNA로 제공됩니다.

Support Products for Double Nickase Plasmids:

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Double Nickase Plasmids 메커니즘

Download Double Nickase Protocols

Activation Plasmids

CRISPR/dCas9 Activation Plasmid product details:

  • 20 µg, 20 transfections
  • CRISPR/dCas9 Activation Plasmids are a synergistic activation mediator (SAM) transcription activation system designed to specifically upregulate gene expression
  • CRISPR/dCas9 Activation Plasmids consist of the following three plasmids at a 1:1:1 mass ratio: a plasmid encoding the deactivated Cas9 (dCas9) nuclease (D10A and N863A) fused to the transactivation domain VP64; a plasmid encoding the MS2-p65-HSF1 fusion protein; and a plasmid encoding a target-specific 20 nt guide RNA
  • gRNA sequences are derived from the CRISPR/Cas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) pooled human library and direct the SAM complex to bind to a site-specific region approximately 200-250 nt upstream of the transcriptional start site of the target gene
  • The SAM system provides robust recruitment of transcription factors for highly efficient activation of the target gene
  • CRISPR/dCas9 Activation Plasmids 는 human 과 mouse 샘플에 제공하고있으며 (h) 나 (m) 로 카탈로그에 표기합니다. 예: p53 CRISPR/dCas9 Activation Plasmids (h) for human or p53 CRISPR/dCas9 Activation Plasmids (m) for mouse
  • Transfection-ready purified plasmid DNA로 제공됩니다.

Support Products for CRISPR Activation Plasmids:

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Activation Plasmids 메커니즘

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Lentiviral Activation Particles

CRISPR/dCas9 Lentiviral Activation Particles product details:

  • Lentiviral Activation Particles encode a synergistic activation mediator (SAM) transcription activation system designed to specifically and efficiently upregulate gene expression via lentiviral transduction of cells (13)
  • The SAM complex binds to a site-specific region approximately 200-250 nt upstream of the transcriptional start site and provides robust recruitment of transcription factors for highly efficient gene activation
  • Lentiviral Activation Particles are supplied frozen in 200 µl of Dulbecco's Modified Eagle Medium with 25 mM HEPES pH 7.3, containing the critical elements in the three CRISPR/dCas9 Activation plasmids, that are required for targeted gene upregulation:
    1. Deactivated Cas9 (dCas9) nuclease (D10A and N863A) fused to the transactivation domain VP64, and blasticidin resistance genes
    2. MS2-p65-HSF1 fusion protein, and hygromycin resistance genes
    3. Target-specific 20 nt. guide RNA, and a Puromycin resistance gene
  • 형질주입이 어려운 세포에 권장합니다
  • CRISPR/dCas9 Lentiviral Activation Particles는 human 과 mouse 샘플에 제공하고있으며 (h) 나 (m) 로 카탈로그에 표기합니다. 예: p53 CRISPR/dCas9 Lentiviral Activation Particles (h) for human or p53 CRISPR/dCas9 Lentiviral Activation Particles (m) for mouse

Support Products for CRISPR Lentiviral Activation Particles:

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Lentiviral Activation Particles 메커니즘

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자주 묻는 질문

  • RNAi에 비한 CRISPR/Cas9 system의 장점은 무엇입니까?

    CRISPR/Cas9 system은 mRNA를 감소하는 RNA interference기술 대신에 타깃프로틴의 DNA을 knocks out합니다. DNA가 편집이 되면 영구적인 변화를 얻게 됩니다.

  • 왜 CRISPR/Cas9유전자편집기술은 zinc-finger nucleases (ZFNs) 이나 TALENs보다 더 주목을 받는거죠?

    CRISPR/Cas9 system은 가격이 비교적 낮고, 효율과 민감성이 뛰어납니다.

  • gRNA sequence는 어떻게 디자인하나요?

    산타크루즈는 GeCKO v2 library에서 발표한 3개의 gRNA 타깃sequence를 사용합니다. 발표된 sequence는 고효율적이며 off target을 감소한다고 증명되였습니다.

  • gRNA sequence를 제공하나요?

    네, 시퀀스는 제공가능합니다. 기술지원팀에 연락주세요.

  • CRISPR/Cas9 KO Plasmid는 왜 3개의 타깃RNA시퀀스를 포함하죠?

    CRISPR/Cas9 KO Plasmid는 새개의 gRNA sequence를 포함하여 유전자파괴를 보장하도록 디자인 되였습니다.

  • HDR Plasmid는 3개의 pool로 제공하나요?

    네, HDR Plasmid는 해당하는 gRNA에 근거하여 디자인 합니다.

  • CRISPR/Cas9 KO Plasmid는 단독으로 사용하여 타깃유전자의 knockout이 가능한가요?

    네, 가능합니다만 non-homologous end-joining (NHEJ)가 발생하여 InDels (삽입이나 삭제)가 일어날수있습니다. InDels는 Open Reading Frame (ORF)를 변화시켜 double strand break (DSB)의 downstream에 아미노산서열을 변화시키거나 premature stop codon을 만듭니다. NHEJ가 일으키는 InDels는 랜덤변이를 발생시키며 유전자파괴정도나 유형을 실험을 통해 확인해야 합니다.

  • CRISPR/Cas9 KO Plasmid가 transfection에 성공하였다는걸 어떻게 확인할수있나요?

    세포는 GFP발현을 분석함으로서 transfection효율을 측정할수 있습니다. 그외 필요한 실험으로 유전자의 knockdown정도를 측정할수있습니다.

  • HDR Plasmid가 transfection에 성공하였다는걸 어떻게 확인할수있나요?

    세포는 RFP발현을 분석함으로서 transfection효율을 측정할수 있습니다. 그외 필요한 실험으로 유전자의 knockdown정도를 측정할수있습니다.

  • CRISPR/Cas9 KO Plasmid 와 HDR Plasmid로 유전자편집이 성공하였다는것을 어떻게 확인할수 있죠?

    유전자 편집에 성공한 세포는 DNA속에 puromycin resistance gene를 포함하고있기 때문에 puromycin selection이 가능합니다.

  • HDR Plasmid의 left homology arms (LHA) 과 right homology arms (RHA) 의 길이는 얼마인가요?

    DNA와 homology directed repair에 proper alignment를 보장하는 800개 염기가 있습니다.

  • CRISPR control은 제공하나요?

    CRISPR/Cas9 KO Plasmid의 negative control로 scrambled gRNA sequence를 포함한 Control CRISPR/Cas9 Plasmid sc-418922를 제공하고 있습니다. Scrambled gRNA sequence는 타깃 DNA와 결합하지 않으며 Cas9/gRNA복합물도 결합하지 않고 DSB를 초래하지 않습니다.

  • PAM sequence는 뭔가요?

    protospacer adjacent motif (PAM) sequence는 DNA타깃시퀀스의 3’ 말단에 존재하여야 하며 이는 gRNA sequence에는 존재하지 말아야 합니다. Cas9가 DNA에 성공적으로 바인딩한후 타깃시퀀스는 가이드RNA와 완벽하게 complimentary되여야 하며 3’ 말단에 곧 PAM시퀀스가 잇따라야 합니다.

  • Cas9/gRNA복합물은 DNA의 어느 위치를 컷트하나요?

    Cas9은 타깃 sequence 3’말단 아래의 약 3-5 base pairs위치를 자릅니다.

  • CRIPSPR/Cas9 system은 dividing 과 non-dividing 세포에 작용할수 있나요?

    네, 분열하는 세포는 NHEJ 나 HDR 경로가 가능하지만 분열하지 않는 세포는 NHEJ만 가능합니다.

  • 세포종류마다 효율이 다른가요?

    네, 세포의 종류와 타깃시퀀스에 따라 결과가 다를수 있습니다.

  • CRISPR/Cas9 system이 타깃유전자 knocked-down에 성공하였다는걸 어떻게 확인할수있나요?

    유전자 knockdown을 확인하는데 두가지 방법이 있습니다. HDR Plasmid로 편집에 성공한후 세포는 puromycin을 함유하게 됩니다. 웨스턴블롯을 이용하여 프로틴의 knockdown을 확인할수 있으며 PCR로 유전자의 knockdown을 확인할수 있습니다. 유전자증폭시 변이가 발생할수있습니다, PCR결과를 클로닝한후 시퀀싱을 하십시요.

  • Western Blot 과/혹은 Immunofluorescence로 어떻게 transfection을 확인합니까?

    Western Blot 과 Immunofluorescence로 Cas9프로틴이 발현되였는지를 확인할수있습니다. 현미경으로 RFP marker의 형광을 관찰하거나 시판 Cas9항체로 확인할수있습니다.

  • 한번에 몇개의 유전자를 knockout할수있죠?

    한번에 knockout가능한 유전자 최다 개수는 측정된바가 없습니다. 연구에 의하면 한번에 여러 유전자의 knockout이 가능하며 이는 세포가 co-transfection에 견디는지에 따라 결정됩니다. 산타크루즈는 한번에 CRISPR/Cas9 KO Plasmids를 하나씩 사용할것을 권장하며 이에따른 보장을 하고있습니다.

  • 산타크루즈의 CRISPR/Cas9 KO plasmid을 사용하려면 어떤 보조 제품과 transfection 시약을 구입해야 하나요?

    Control CRISPR/Cas9 Plasmid sc-418922, Ultracruz Transfection Reagent sc-395739, Plasmid Transfection Medium sc-108062, Puromycin dihydrocholoride sc-108071. We also offer control antibodies for each target-specific CRISPR/Cas9 KO Plasmid.

  • CRISPR제품은 맞춤제작이 가능한가요?

    기술지원팀에 연락하여 자세한 정보를 확인하세요.

  • 재고가 없는 CRISPR제품의 예정일은 얼마인가요?

    10-14 days

References

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