遺伝子サイレンサー

Santa Cruz Biotechnology now offers target-specific CRISPR/Cas9 Knockout (KO) Plasmids, CRISPR Double Nickase Plasmids, CRISPR/ dCas9 Activation Plasmids and CRISPR Lenti Activation Systems for over 18,910 human and 18,340 mouse protein encoding genes.

RNAiの歴史

RNA干渉 (RNAi)は、ノーベル賞受賞者のFire と Mello (1)により、C. elegansを用いて確認され、今現在では分子生物学での有望な発見の内の一つとして表されてます。内在性のRNAi活性は、トランスポゾンの移動性制御 (2)、遺伝子発現の特性判定 (3)や細胞運命判定 (4)に結びつけられ、ウイルス感染 (in vivo) に対する自然細胞防御の重要な成分です(5)。ターゲット遺伝子発現を制御してる三つの独特なRNAiメカニズムが立証されてます。RNAiは、ヘテロクロマチン構造を修飾することによって遺伝子転写を制御します (6)。 RNAiは二つのフォームの転写後のコントロールをエクササイズします。RNAiがターゲットmRNAの翻訳を抑制し (7)、RNAiがRISC複合体を通じてターゲットmRNA破壊へと仕向けます (8)。はじめに、DICERが3'突出末端を持つ二つのヌクレオチド長を残したdsRNAを過程します。そして、RISC複合体へ結合してdsRNAを刺激し、アルゴノートの酵素によっての活性化、RISC複合体のRNAse成分が一本のRNA鎖を破壊する現象を引き起こします。siRNAを構成する二本鎖のうち相補的な鎖であるガイド鎖が、RISC複合体を付随し、標的RNA分子を切断します。

RNAiの発見は、有力な研究ツールとして紹介され、見込みのある有望な治療手段ともなりました。そのようなことから、 Andrew Z. Fire と Craig C. Melloが2006年のノーベル生理学医賞を受賞しました。研究所では、上記に記述されてる三つの遺伝子発現抑制のメカニズムを利用することにより、RNA分子が、様々な生物や細胞タイプで各標的遺伝子の発現を下方制御することに使われてます。これらの手法は、個々の遺伝子やタンパク機能及びそれらの関連性を探究するための実験システムを操作することに、大変便利となっております。更にRNAiは、臨床上の有望もあります 1。

これらのRNAiメカニズムについては、厳重な研究対象である中、まだ多くのことが明らかになっていません。RISC複合体を通じてターゲットmRNA分解するRNAiコントロールについては、RNAi遺伝子サイレンサーを目的とするメカニズムである上に、大変に記述がはっきりとしてます。

Santa Cruz Biotechnology, Inc. では、> 99%以上のヒトとマウスタンパクコード遺伝子をカバーしてる siRNA、 shRNA プラスミド や shRNA レンチウイルス製品を含む、完全ラインのRNAi 遺伝子サイレンサーを提供しております。

Santa Cruz Biotechnology, Inc. から提供しておりますRNA干渉製品

siRNA遺伝子サイレンサー

siRNA description:

  • siRNA は、『small interfering RNA』または『short interfering RNA』とも呼ばれてます
  • 脂質ベースのトランスフェクション試薬を使って、細胞をトランスフェクションする必要があります
  • 『Transient』なノックダウンに有用

siRNA product details:

  • 弊社で提供しておりますsiRNA遺伝子サイレンサーは、各末端に2-nt 3'オーバーハングを持つ3種類のターゲット特異的な19-25 nt長さの二本鎖RNA分子がプールされてます
  • 10 µM, 50-100 transfections
  • ターゲット遺伝子サイレンシングを独立的に検証できるよう、個々のsiRNAもリクエストに応じてご用意できます

Support Products for siRNA Gene Silencers:

  • 適したコントロール抗体もご用意しております
  • RT-PCRプライマーもご用意しております
  • siRNA Dilution Buffer, sc-29527
  • siRNA Transfection Reagent, sc-29528
  • siRNA Transfection Medium, sc-36868
  • siRNA Reagent System, sc-45064
  • Control siRNAs, including Control siRNA-A, sc-37007
  • Control siRNA (FITC Conjugate)-A, sc-36869
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siRNA 遺伝子サイレンサーの仕組み

Download siRNA Protocols

FGF-19 siRNA (h): sc-39480

CD9 siRNA (h): sc-35032

Daxx siRNA (h): sc-35178

Cdc6 siRNA (h): sc-29258

cytochrome c siRNA (h): sc-29292

cPLA2 siRNA (h): sc-29280

ERK 1 siRNA (m): sc-29308

c-Src siRNA (h): sc-29228

p53 siRNA (h): sc-29435

Lamin A/C siRNA (h): sc-35776

shRNAプラスミド遺伝子サイレンサー

shRNA Plasmid description:

  • shRNA は、『small hairpin RNA』または『short hairpin RNA』と呼ばれてます
  • shRNAをコードしてるプラスミドは、脂質ベースのトランスフェクションと通じて細胞へ入ります
  • shRNA プラスミドは、『transient』または『stable』なターゲット遺伝子発現の抑制にご使用できます
  • 弊社で提供しておりますshRNA プラスミドは、6 bp ループを持つ3から5種類のターゲット特異的な19-25 ntのレンチウイルスベクタープラスミドがプールされてます
  • 20 µg, ~20回トランスフェクション
  • shRNA トランスフェクションは、H1 プロモーターの制御下にあります
  • 『transfection-ready』の精製したプラスミドDNAとして提供しております
  • トランスフェクション後、shRNAを安定に発現する細胞は、ピューロマイシンを選択することで、分離できます

Support Products for shRNA Plasmid Gene Silencers:

  • 適したコントロール抗体もご用意しております
  • RT-PCRプライマーもご用意しております
  • shRNA Plasmid Transfection Reagent, sc-108061
  • shRNA Plasmid Transfection Medium, sc-108062
  • Control shRNA Plasmid-A, sc-108060
  • Control shRNA Plasmid-B, sc-108065
  • Control shRNA Plasmid-C, sc-108066

Confirm shRNA Plasmid Gene Silencer transfection efficiency with copGFP Control Plasmid: sc-108083

shRNAの安定発現で細胞を産生する

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shRNA プラスミド遺伝子サイレンサーの仕組み

Download shRNA Protocols

IL-1α shRNA Plasmid (h): sc-39613-SH

PTN shRNA Plasmid (m): sc-39714-SH

TCF-4 shRNA Plasmid (h): sc-43525-SH

MIS shRNA Plasmid (h): sc-39793-SH

VEGF-D shRNA Plasmid (h): sc-39844-SH

Amylase shRNA Plasmid (h): sc-29675-SH

FGF-19 shRNA Plasmid (h): sc-39480-SH

MMP-9 shRNA Plasmid (h): sc-29400-SH

BMP-4 shRNA Plasmid (h): sc-39744-SH

Cyr61 shRNA Plasmid (h): sc-39331-SH

shRNA レンチウイルス粒子

shRNA Lentiviral Particle description:

  • shRNA は、『small hairpin RNA』または『short hairpin RNA』と呼ばれてます
  • レンチウイルス粒子がshRNAをコードしているプラスミドをターゲット細胞へ届けます
  • ターゲット遺伝子の『transient ノックダウン』または『stable ノックダウン』に有用
  • レンチウイルス粒子は、ヒトやマウスの哺乳類細胞の遺伝子サイレンシングを行うための『transduction-ready ウイルス』として提供しております
  • 200 µlの凍結されたウィルス株は106のウィルス感染単位(IFU)を含め、10-20回のトランスダクションができます。
  • レンチウイルス粒子は通常、6 bpループを持つ3から5種類のターゲット特異的な19-25 ntの発現コンストラクトを含みます
  • 導入後、shRNAを安定に発現する細胞は、ピューロマイシンを選択することで、分離できます
  • copGFP コントロールレンチウイルス粒子から、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡により検出できますGFP発現にて、ターゲット細胞ポピュレーション内のレンチウイルス粒子の導入効率を確認できます
  • shRNA レンチウイルス粒子の使用の利点としては、過度なトランスフェクション法を避けてどの細胞タイプにもhRNAを導入できることです
  • バイオセイフティーについて - レンチウイルス粒子は、複製能がなく、ターゲット細胞のゲノムDNAにshRNAコンストラクを導入して組み込みした後、自己不活化するようにデザインされてます。

Support Products for shRNA Lentiviral Particle Gene Silencers:

  • 適したコントロール抗体もご用意しております
  • RT-PCRプライマーもご用意しております
  • Control shRNA Lentiviral Particles: sc-108080
  • copGFP Control Lentiviral Particles: sc-108084
  • Puromycin dihydrochloride: sc-108071

shRNAの安定発現で細胞を産生する

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レンチウイルス粒子遺伝子サイレンサーの仕組み

Download Lentiviral Protocols

効果的な導入コントロールのご使用

copGFP コントロールレンチウイルス粒子

293T cells stably transduced with copGFP Control Lentiviral Particles (sc-108084) compared with non-transduced 293T cells as a negative control.


PNP shRNA (h) Lentiviral Particles: sc-45991-V

ephrin-A1 shRNA (m) Lentiviral Particles: sc-39427-V

MCP-4 shRNA Plasmid (h): sc-72122-SH

TNFβ shRNA Plasmid (h): sc-37218-SH

Somatostatin shRNA (h) Lentiviral Particles: sc-39728-V

Fos B shRNA (h) Lentiviral Particles: sc-35403-V

頻繁に尋ねられる質問

  • shRNAの使用は、siRNAと比較し、どのような特長がありますか?

    siRNA遺伝子サイレンサーを培養細胞に導入することにより、速く、効率的に、短期間で標的遺伝子発現を抑制します。shRNA プラスミドや shRNA レンチウイルス粒子を使用し、ピューロマイシンを選択することにより、安定的に遺伝子発現を抑えることができるでしょう。そのため、遅代謝回転でのタンパク発現を標的しているのでしたら、shRNA プラスミドまたはshRNA レンチウイルス粒子のご使用をお奨めいたします。

  • shRNA レンチウイルス粒子とshRNA プラスミドの使うにあたっての違いは、何ですか?

    shRNA プラスミドによる標的遺伝子のサイレンシングでは、トランスフェクションする必要がありますが、shRNA レンチウイルス粒子の場合は、初代細胞や非分裂細胞を含みますほとんどの哺乳類細胞タイプへすぐに加えられる状態でお届きになります。shRNA プラスミドやshRNA レンチウイルス粒子の各製品は、ピュ-ロマイシン処理により安定性のあるshRNAの発現することに使えるでしょう。レンチウイルス粒子は、ドライアイスにて、shRNA プラスミドはブルーアイスで出荷いたします。

  • レンチウイルス shRNA製品は、安全性に関して提起しますか?

    レンチウイルス粒子は、バイオセーフティーレベル (standard Biosafety Level) グループ2 組織培養施設で使用することができますが、他の感染性試薬と同様な注意のもとで扱うべきです。レンチウイルス粒子は複製能がなく、shRNAコンストラクトがゲノムDNAの標的細胞へトランスダクション、組み込まれた後、自己不活化するようにデザインされてます。

  • shRNA 製品の配列は、同じ遺伝子の関連するsiRNA 製品のものと同様の配列を使用してますか? 配列の入手は、可能でしょうか?

    はい、弊社のshRNA プラスミドにコードしてる配列は、siRNA 遺伝子サイレンサー製品に使われてるものと同様です。配列情報を提供することはできますので、是非テクニカルサポートまでお問い合わせください。

  • shRNA プラスミドは、3から5種類のプラスミドがプールされていますが、それぞれ別々のバイアルに入ってるのですか? プールされてる製品の個々のshRNA プラスミドを別々に販売してますか?

    shRNA プラスミドは、一本のバイアルでお届けしております。siRNA ストランドでしたら、ご要望により別々販売をしておりまして、プラスミドもいずれ、別々販売が可能になります。

  • どのようなレンチウイルスベクターを使ってるのですか? "ベクター名"は、何でしょうか?

    弊社で使ってますレンチウイルスベクターはカスタムメイドでして、ベクターは非公開となっております。必要とします内容およびその理由をお知らせくだされば、非公開としてます情報を開示せずにご質問にご回答できるかもしれません。

  • shRNA転写では、どのようなタイプのプロモーターがベクターに使用されてますか?

    ベクターには、H1 プロモーターを使用しております

  • どのようなセレクションマーカーがベクターに含まれてますか?

    うまくトランスフェクトまたは形質導入された細胞を選択するために、ベクターには、N-アセチルトランスフェラーゼ酵素をコードしてるピューロマイシン耐性遺伝子が含まれてます。

  • どのようにレンチウイルスベクタープラスミドを増殖すればよいのですか?

    shRNA プラスミドおよびレンチウイルス粒子は、transfection / transduction ready製品として販売しておりますので、さらなる調整の必要性はございません。shRNA 遺伝子サイレンサーは、増殖プロとコールの用意がされてない消耗品です。

  • copGFPとは、何ですか? shRNA プラスミドやレンチウイルス粒子との使用の際、どのような有益があるのですか?

    別々のターゲット細胞のサンプルへcopGFP プラスミドやcopGFP レンチウイルス粒子を投与することにより、標的細胞のポピュレーションのトランスフェクションやウイルス導入効率を確認することができるでしょう。copGFP プラスミドやcopGFP レンチウイルス粒子が、蛍光顕微鏡またはフローサイトメーターの使用によって検出できるカイアシ類緑色蛍光タンパク質の発現へと、導きます。

  • (h) と (h2) shRNA 製品の違いは何でしょうか?(例: E-Cadherin, sc-35242-SH と sc-44222-SH)

    (h) と (h2) 製品は、同様の遺伝子をサイレンスするようにデザインされてますが、各異なった配列が用いられてます。

  • 御社のshRNA プラスミドを使用するにあたり、どのようなサポート品やトランスフェクション試薬を購入するべきですか?

    shRNA Plasmid DNA Transfection Reagent, sc-108061 そして shRNA Plasmid DNA Transfection Medium, sc-108062を推奨いたします。更に sc-108060 (A), sc-108065 (B) または sc-108066 (C) としてご用意しとります control shRNA Plasmid DNA もお奨めいたします。これらのコントロール製品は、知られてる哺乳類mRNAを標的にすることのないスクランブル配列をコードします。

参考文献

  1. Fire, A., Xu, S.Q., Montgomery, M.K., Kostas, S.K., Driver, S.E. and Mello, C.C. 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811.

  2. Das, P.P., Bagijn M.P., Goldstein, L.D., Woolford, J.R., Lehrbach, N.J., Sapetschnig, A., Buhecha, H.R., Gilchrist, M.J., Howe, K.L., Stark, R., Matthews, N., Berezikov, E., Ketting, R.F., Tavaré, S. and Miska E.A. 2008. Piwi and piRNAs Act Upstream of an Endogenous siRNA Pathway to Suppress Tc3 Transposon Mobility in the Caenorhabditis elegans Germline. Mol Cell 31: 79-90.

  3. Kawasaki, H., Taira, K. and Morris, K.V. 2005. siRNA Induced Transcriptional Gene Silencing in Mammalian Cells. Cell Cycle 4: 442-448.

  4. Georgantas III, R.W., Hildreth, R., Morisot, S., Alder, J., Liu, C.G., Heimfeld, S., Calin, G.A., Croce, C.M. and Civin, C.I. 2007. CD34+ hematopoietic stem-progenitor cell microRNA expression and function: A circuit diagram of differentiation control. PNAS 104: 2750-2755.

  5. Chotkowskia, H.L., Ciotab, A.T., Jiab, Y., Puig-Basagoitic, F., Kramerb, L.D., Shic, P.Y. and Glaser, R.L. 2008. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology 377: 197-206.

  6. Kawasaki, H., Taira, K. and Morris, K.V. 2005. siRNA Induced Transcriptional Gene Silencing in Mammalian Cells. Cell Cycle 4: 442-448.

  7. Tamura, Y., Yoshida, M., Ohnishi, Y. and Hohjoh, H. 2008. Variation of gene silencing involving endogenous microRNA in mammalian cells. Mol Biol Rep, epub.

  8. Hammond,S.M., Boettcher, S., Caudy, A.A., Kobayashi, R. and Hannon, G.J. 2001. Argonaute2, a Link Between Genetic and Biochemical Analyses of RNAi. Science 293: 1146-1150.

  9. Zhanga, Y., Yanga, H., Xiaoa, B., Wub, M., Zhoua, W., Lia, J., Lib, G. and Christados, P. 2008. Dendritic cells transduced with lentiviral-mediated RelB-specific ShRNAs inhibit the development of experimental autoimmune myasthenia gravis. Mol Imunol, epub.

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