Silenziamento genico

Santa Cruz Biotechnology now offers target-specific CRISPR/Cas9 Knockout (KO) Plasmids, CRISPR Double Nickase Plasmids, CRISPR/ dCas9 Activation Plasmids and CRISPR Lenti Activation Systems for over 18,910 human and 18,340 mouse protein encoding genes.

Storia della RNAi

La RNA interference (RNAi) è stata inizialmente caratterizzata in C. elegans dai premi Nobel Fire e Mello (1) e rappresenta oggi una delle più promettenti scoperte nell'ambito della biologia molecolare. L'attività endogena della RNAi è stata associata alla regolazione della mobilità di trasposoni (2), alla determinazione dei profili di espressione genica (3) , al destino cellulare (4) e riveste inoltre una funzione cruciale nell'innata resistenza cellulare contro le infezioni virali (5). Finora sono stati individuati tre meccanismi della RNAi che regolano l'espressione di un gene target. La RNA interference controlla la trascrizione del gene modificando la formazione dell'eterocromatina (6) ed esercita due tipi di controllo post-trascrizionale. Da un lato, la RNAi è in grado di inibire la traduzione di mRNA (7), dall'altro lato può direttamente avviare la degradazione del mRNA tramite il complesso RISC (8). L'enzima DICER taglia l'RNA a doppio filamento (RNAds) prima in filamenti con due nucleotidi sporgenti ad ognuna delle due estremità 3'. Ciò induce la RNAds a legarsi al complesso RISC e provoca l'azione enzimatica di argonaute, un componente del complesso RISC che degrada uno dei filamenti della RNAds. Attraverso un appaiamento complementare il filamento guida si associa a un filamento di mRNA e il complesso RISC degrada successivamente le molecole bersaglio della RNA.

Con la scoperta della RNAi è stato introdotto uno strumento estremamente utile per la ricerca scientifica, che lascia sperare anche in una futura applicazione terapeutica. Di conseguenza, il premio Nobel dell'anno 2006 per la fisiologia e la medicina è stato assegnato a Andrew Z. Fire e Craig C. Mello. Nel laboratorio le molecole RNAi sono utilizzate per regolare l'espressione genica di vari organismi e tipi di cellule, sfruttando i tre meccanismi di inibizione genica menzionati sopra. Queste tecniche consentono di individuare le funzioni di determinati geni e proteine e le relazioni tra di loro. Inoltre la RNAi offre molteplici possibilità di applicazioni cliniche (9).

Questi meccanismi della RNAi sono oggetto di diversi studi ambiziosi, però non tutti i processi sono chiari finora. La RNAi che regola la degradazione di mRNA attraverso il complesso RISC rappresenta però il meccanismo meglio descritto e compreso.

Santa Cruz Biotechnology, Inc. offre un ampia gamma di RNAi Gene Silencers, compresi siRNA, shRNA plasmidi e prodotti lentivirali shRNA, che coprono più del 99% dei geni codificanti per le proteine umane e murine.

Degradazione di mRNA avviato dalla RNAi

Prodotti di RNA interference offerti da Santa Cruz Biotechnology Inc.

Silenziatori genici siRNA

siRNA description:

  • siRNA significa 'small interfering' o 'short interfering' RNA
  • Richiede una trasfezione cellulare tramite un reagente di trasfezione basato su lipidi.
  • Utilizzabile nella trasfezione transiente (knock-down)

siRNA product details:

  • Gli siRNA Gene Silencers sono gruppi di tre molecole RNA a doppio filamento target specifiche, lunghe 19-25 nucleotidi con 2 nucleotidi protruding in 3'.
  • 10 µM, 50-100 transfezioni
  • Per verificare indipendentemente i risultati del silenziamento del gene bersaglio, vi sono disponibili su richiesta componenti individuali di siRNA a doppio filamento.

Support Products for siRNA Gene Silencers:

  • anticorpi di controllo disponibili
  • RT-PCR primer
  • siRNA Dilution Buffer, sc-29527
  • siRNA Transfection Reagent, sc-29528
  • siRNA Transfection Medium, sc-36868
  • siRNA Reagent System, sc-45064
  • Control siRNAs, including Control siRNA-A, sc-37007
  • Control siRNA (FITC Conjugate)-A, sc-36869
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Come funzionano siRNA Gene Silencers?

Download siRNA Protocols

FGF-19 siRNA (h): sc-39480

CD9 siRNA (h): sc-35032

Daxx siRNA (h): sc-35178

Cdc6 siRNA (h): sc-29258

cytochrome c siRNA (h): sc-29292

cPLA2 siRNA (h): sc-29280

ERK 1 siRNA (m): sc-29308

c-Src siRNA (h): sc-29228

p53 siRNA (h): sc-29435

Lamin A/C siRNA (h): sc-35776

shRNA Plasmidi Gene Silencers

shRNA Plasmid description:

  • shRNA sat per 'small hairpin' o per 'short hairpin' RNA
  • Plasmidi codificanti per shRNA vengono inseriti nella cellula attraverso la trasfezione basata su lipidi.
  • Plasmidi shRNA sono utilizzabili per inibizione transigente o stabile dell'espressione genica.
  • I plasmidi shRNA sono forniti come gruppo da tre a cinque plasmidi vettori lentivirali, ciascun plasmide codifica per uno specifico shRNA di 19-25 nt con un'ansa di 6 bp.
  • 20 µg, fino a 20 transfezioni
  • La transcrizione shRNA è posta sotto il controllo del promotore dell'istone H1.
  • fornito come DNA plasmidico purificato pronto per la trasfezione
  • Dopo la trasfezione le cellule che esprimono shRNA in modo stabile possono essere selezionate tramite un trattamento con puromicina.

Support Products for shRNA Plasmid Gene Silencers:

  • anticorpi di controllo disponibili
  • RT-PCR primer
  • shRNA Plasmid Transfection Reagent, sc-108061
  • shRNA Plasmid Transfection Medium, sc-108062
  • Control shRNA Plasmid-A, sc-108060
  • Control shRNA Plasmid-B, sc-108065
  • Control shRNA Plasmid-C, sc-108066

Confirm shRNA Plasmid Gene Silencer transfection efficiency with copGFP Control Plasmid: sc-108083

Generare cellule con espressione stabile di shRNA

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Come funzionano gli shRNA Plasmid Gene Silencers?

Download shRNA Protocols

IL-1α shRNA Plasmid (h): sc-39613-SH

PTN shRNA Plasmid (m): sc-39714-SH

TCF-4 shRNA Plasmid (h): sc-43525-SH

MIS shRNA Plasmid (h): sc-39793-SH

VEGF-D shRNA Plasmid (h): sc-39844-SH

Amylase shRNA Plasmid (h): sc-29675-SH

FGF-19 shRNA Plasmid (h): sc-39480-SH

MMP-9 shRNA Plasmid (h): sc-29400-SH

BMP-4 shRNA Plasmid (h): sc-39744-SH

Cyr61 shRNA Plasmid (h): sc-39331-SH

Particelle lentivirali shRNA

shRNA Lentiviral Particle description:

  • shRNA sat per 'small hairpin' o per 'short hairpin' RNA
  • Le particelle lentivirali trasferiscono un plasmide codificante per shRNA in una cellula bersaglio.
  • Utilizzabile sia per il knock-down transiente che stabile di un gene bersaglio.
  • Le particelle lentivirali per il silenziamento genico nelle cellule di mammifero (umane o murine) vengono fornite come virus pronti per la trasduzione.
  • 200 µl della soluzione virale congelata contengono 106 particelle virali infettive, sufficienti per 10-20 trasduzioni.
  • Le particelle lentivirali contengono di regola tre a cinque vettori di espressione, che codificano ciascuno per un shRNA specifico di 19-25 nt con un'ansa di 6 bp.
  • Dopo la trasduzione le cellule che esprimono shRNA in modo stabile possono essere selezionate tramite un trattamento con puromicina
  • Le particelle lentivirali di controllo copGFP permettono di verificare l'efficienza di trasduzione delle particelle lentivirali nelle coltivazioni cellulari tramite l'espressione di GFP, che è rilevabile con la citometria a flusso o la microscopia a fluorescenza.
  • I vantaggi di utilizzare particelle lentivirali shRNA includono la possibilità di evitare le difficili tecniche di trasfezione e l'abilità di introdurre shRNA in ogni tipo di cellula
  • Biosafety information - Lentiviral Particles are replication-incompetent and are designed to self-inactivate after transduction and integration of shRNA constructs into the genomic DNA of target cells.

Support Products for shRNA Lentiviral Particle Gene Silencers:

  • anticorpi di controllo disponibili
  • RT-PCR primer
  • Control shRNA Lentiviral Particles: sc-108080
  • copGFP Control Lentiviral Particles: sc-108084
  • Puromycin dihydrochloride: sc-108071

Generare cellule con espressione stabile di shRNA

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Come funzionano le particelle lentivirali shRNA?

Download Lentiviral Protocols

Utilizzare un efficace controllo di trasduzione

Particelle lentivirali di controllo copGFP

293T cells stably transduced with copGFP Control Lentiviral Particles (sc-108084) compared with non-transduced 293T cells as a negative control.


PNP shRNA (h) Lentiviral Particles: sc-45991-V

ephrin-A1 shRNA (m) Lentiviral Particles: sc-39427-V

MCP-4 shRNA Plasmid (h): sc-72122-SH

TNFβ shRNA Plasmid (h): sc-37218-SH

Somatostatin shRNA (h) Lentiviral Particles: sc-39728-V

Fos B shRNA (h) Lentiviral Particles: sc-35403-V

FAQ

  • Quali sono i vantaggi di utilizzare shRNA invece che siRNA?

    La trasfezione dei silenziatori genici nelle cellule in cultura fornisce una rapida ed efficiente, anche se a breve termine, diminuzione nell'espressione del gene target. Si potrebbe ottenere un silenziamento stabile di un gene utilizzando plasmidi shRNA o particelle lentivirali shRNA seguite da selezione su puromicina. In questo modo, se si ha come target l'espressione di una proteina con un lento turn-over, il plasmide shRNA o le particelle lentivirali shRNA sarebbero ideali per realizzare l'obiettivo.

  • Qual'è la differenza tra l'utilizzare particelle lentivirali shRNA invece dei plasmidi shRNA?

    La trasfezione è richiesta per utilizzare plasmidi shRNA per il silenziamento di geni target. Mentre le particelle lentivirali shRNA arrivano pronte per essere aggiunte virtualmente a qualsiasi tipo di cellula di mammifero, incluse cellule primarie e non in divisione. Sia i plasmodi shRNA e le particelle lentivirali potrebbero essere utilizzati per sviluppare un'espressione stabile del shRNA con utilizzo di puromicina. Le particelle lentivirali sono spedite su in ghiaccio secco mentre i plasmodi shRNa vengono spediti in blue ice.

  • I prodotti shRNA lentivirali possono sollevare qualche problema di sicurezza?

    Le particelle lentivirali possono essere utilizzate in condizioni di coltura di tessuto standard con biosicurezza di livello 2 (e devono essere trattate con lo stesso livello di sicurezza di ogni altro potenziale reagente infettivo). Le particelle lentivirali non sono in grado di replicarsi e sono disegnate in modo tale da inattivarsi dopo la traduzione e l'integrazione dei costrutti shRNA nel DNA genomico delle cellule target.

  • Le sequenze dei vostri prodotti shRNA sono le stesse dei prodotti siRNA collegati allo stesso gene? Queste sequenze sono disponibili?

    Sí. Le sequenze codificate nei nostri plasmidi shRNA sono le stesse usate nei corrispondenti prodotti di silenziatori genici siRNA. Queste sequenze sono disponibili per i clienti. Contattare il vostro rappresentante del servizio tecnico.

  • I plasmidi shRNA sono forniti come un gruppo da tre a cinque plasmidi. Sono forniti in fiale separate? I plasmidi shRNA singoli del prodotto raggruppato sono venduti anche separatamente?

    I prodotti plasmidi shRNA sono forniti in una fiala. Offriamo gli strand di siRNA separatamente solo su richiesta. In futuro potremmo offrire i plasmidi separatamente.

  • Che genere di vettore lentivirale viene utilizzato? Qual'è il "vector name"?

    Il vettore lentivirale che noi usiamo è un vettore brevettato, su misura. Per favore, ci faccia sapere quale informazione sta cercando e perché ne ha bisogno. Potremmo essere in grado di risponderle senza violare le informazioni protette da brevetto.

  • Quale tipo di promotore usa il tuo vettore per la trascrizione dell'shRNA?

    Il vettore usa un promotore H1

  • Quale tipo di marcatore/i di selezione ci sono nel vettore?

    Il vettore contiene un gene per la resistenza alla Puromicina che codifica per l'enzima N-acetiltransferasi per la seguente selezione delle cellule trasfettate o trasdotte.

  • Come propagate il vettore plasmidico lentivirale?

    I Plasmidi shRNA e le particelle lentivirali sono venduti come prodotti già pronti alla trasfezione/trasduzione. Non è necessaria nessuna ulteriore preparazione. I silenziatori genici sono prodotti consumabili per cui non sono previsti protocolli di propagazione.

  • Che cos'è copGFP e come può essere utile nell'utilizzo dei plasmidi e delle particelle lentivirali?

    Somministrando il plasmide copGFPo le particelle lentivirali copGFP ad un campione separato di cellule target, una può identificare la trasfezione o l'efficienza di trasduzione virale per la popolazione celllare target. Il plasmide copGFP e le particelle lentivirali copGFP portano all'espressione della proteina fluorescente copepod green che può essere rilevata utilizzando un microscopio a fluorescenza o un citometro a flusso.

  • Qual'è la differenza tra i prodotti shRNA (h) e (h2) (per esempio E-Caderina, sc-35242-SH e sc-44222-SH)?

    I prodotti (h) e (h2) sono progettati per silenziare lo stesso gene, ma hanno sequenze differenti.

  • Quali prodotti di supporto e quali reagenti di trasfezione devo acquistare dalla SCBT per utilizzare i vostri plasmidi shRNA?

    Suggeriamo il nostro reagente di trasfezione shRNA Plasmid DNA, sc-1018061 in aggiunta al terreno per trasfezione shRNA Plasmid, sc-108062

Referenze

  1. Fire, A., Xu, S.Q., Montgomery, M.K., Kostas, S.K., Driver, S.E. and Mello, C.C. 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811.

  2. Das, P.P., Bagijn M.P., Goldstein, L.D., Woolford, J.R., Lehrbach, N.J., Sapetschnig, A., Buhecha, H.R., Gilchrist, M.J., Howe, K.L., Stark, R., Matthews, N., Berezikov, E., Ketting, R.F., Tavaré, S. and Miska E.A. 2008. Piwi and piRNAs Act Upstream of an Endogenous siRNA Pathway to Suppress Tc3 Transposon Mobility in the Caenorhabditis elegans Germline. Mol Cell 31: 79-90.

  3. Kawasaki, H., Taira, K. and Morris, K.V. 2005. siRNA Induced Transcriptional Gene Silencing in Mammalian Cells. Cell Cycle 4: 442-448.

  4. Georgantas III, R.W., Hildreth, R., Morisot, S., Alder, J., Liu, C.G., Heimfeld, S., Calin, G.A., Croce, C.M. and Civin, C.I. 2007. CD34+ hematopoietic stem-progenitor cell microRNA expression and function: A circuit diagram of differentiation control. PNAS 104: 2750-2755.

  5. Chotkowskia, H.L., Ciotab, A.T., Jiab, Y., Puig-Basagoitic, F., Kramerb, L.D., Shic, P.Y. and Glaser, R.L. 2008. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology 377: 197-206.

  6. Kawasaki, H., Taira, K. and Morris, K.V. 2005. siRNA Induced Transcriptional Gene Silencing in Mammalian Cells. Cell Cycle 4: 442-448.

  7. Tamura, Y., Yoshida, M., Ohnishi, Y. and Hohjoh, H. 2008. Variation of gene silencing involving endogenous microRNA in mammalian cells. Mol Biol Rep, epub.

  8. Hammond,S.M., Boettcher, S., Caudy, A.A., Kobayashi, R. and Hannon, G.J. 2001. Argonaute2, a Link Between Genetic and Biochemical Analyses of RNAi. Science 293: 1146-1150.

  9. Zhanga, Y., Yanga, H., Xiaoa, B., Wub, M., Zhoua, W., Lia, J., Lib, G. and Christados, P. 2008. Dendritic cells transduced with lentiviral-mediated RelB-specific ShRNAs inhibit the development of experimental autoimmune myasthenia gravis. Mol Imunol, epub.

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