Sistema CRISPR

Santa Cruz Biotechnology now offers target-specific CRISPR/Cas9 Knockout (KO) Plasmids, CRISPR Double Nickase Plasmids, CRISPR/ dCas9 Activation Plasmids and CRISPR Lenti Activation Systems for over 18,910 human and 18,340 mouse protein encoding genes.

Historia del CRISPR/Cas9

El sistema CRISPR/Cas9 es un mecanismo de defensa adaptativa utilizado por Archea y bacterias para degradar material genético extraño. En estos organismos, el material genético extraño de un bacteriófago es integrado en el loci CRISPR (1,2). Este nuevo material, también conocido como espaciador, genera un fragmento de secuencia especifica que será utilizado como resistencia contra futuras infecciones del bacteriófago. Estos fragmentos de secuencia especifica se traducen en CRISPR ARNs cortos (crRNAs) y funcionan como guía para dirigir la excisión del ADN invasor complementario, mediante actividad nucleasa de la proteína CRISPR- asociada (Cas) codificada también en el loci CRISPR (1,2). La nucleasea Cas9 del sistema CRISPR tipo II tiene un dominio de unión al ARN, y un lóbulo hélice alfa (REC), un lóbulo de nucleasa que incluye, RuvC y HNH para la escisión del ADN y un motivo adyacente protospacer (PAM) que interactúa con (1,2). crARN forma un complejo con la nucleasa Cas9 mediante unión de la hélice alpha con el Lóbulo REC y genera múltiples puentes con la columna de crARN (1,2,3).

Tras la unión de crRNA a Cas9 la conformación de la nucleasa Cas9 se modifica generando un canal que permite la unión al ADN (1,2,3). El complejo Cas9 / crRNA analiza el ADN en busca de un motivo PAM (5'-NGG) (4,5,6). El reconocimiento de un motivo de PAM induce un desenrollamiento del ADN que permite al crRNA buscar el ADN complementario adyacente al motivo PAM. Cuando Cas9 se une a un motivo PAM adyacente a una secuencia de ADN complementaria a la de crRNA, la hélice puente dentro del lóbulo REC crea un heterodúplex de ARN-ADN con el ADN diana (3,4,7). El reconocimiento del sitio PAM está implicado en la activación de los dominios HNH y RuvC lo que produce la rotura de la doble cadena (DSB) del ADN diana, esto lleva a la degradación del ADN (1,2,5,8) . Si el crRNA no es complementario, Cas9 se libera y busca otro sitio PAM (7). La rotura del ADN diana pueden ser reparado mediante el mecanismo conocido como Recombinación no homóloga (NHEJ), que introduce o elimina nucleótidos, generando errores, o a través de Recombinación homóloga (HDR), que puede ser utilizado para introducir marcadores en sitios específicos del genoma (2,9,10). Este mecanismo CRISPR /Cas9 puede ser utilizado en ingeniería genómica de varios sistemas, incluyendo las células de mamíferos.

Modificaciones en el Genoma tras la rotura de la doble cadena (DSBs) pueden realizarse con meganucleasas, Nucleasas con dedos de Zinc (ZF) ó transactivator-like effectors (TALEs), que reconocen secuencias de ADN, sin embargo cada uno tiene sus limitaciones. Las meganucleasas no permiten un reconocimiento especifico entre nucleasas y ADN (2). Las otras dos opciones, ZFs y TALEs, son difíciles de diseñar y reconocen un máximo de 3 nucleótidos de ADN (2). Las guias de ARN de una cadena (sgRNAs) que actúan como crRNAs son fáciles de diseñar y pueden expresarse junto con la nucleasa Cas9 en un mismo vector para hacer diana en secuencias especificas del ADN y realizar las modificaciones del genoma. El sistema CRISPR/ Cas 9 tiene además mayor sensibilidad y es más eficiente cuando se usa para detectar pequeñas horquillas de ARN.

Una gran ventaja de usar el sistema CRISPR/Cas 9 para generar un corte en el ADN genómico es la alta eficiencia. Sin embargo, esta eficiencia puede verse empañada por un efecto off- target que reduce la especificidad de la edición CRISPR/Cas 9. La especificidad puede mejorarse con el uso del sistema Doble Nickase CRISPR, mediante el cual un par de plásmidos, cada uno codificando una CAS9 (D10A) nickase mutante (Cas9n) que se dirigen a una región especifica y diferente mediante dos guias de ARN (12). Cada complejo Cas9n/sgARN corta una vez la cadena de ADN complementaria al ARN guia (12). Cada par de guías tiene una distancia de unas 20 pb y reconoce secuencias localizadas en las cadenas opuestas del ADN diana. El doble Nick con el par de Cas9n/sgARN imita un corte de Doble cadena en el ADN (12). Por lo que el uso de las pareja de ARN guia permite una mayor especificad mientras mantiene un alto nivel de eficiencia.

Además de la edición del genoma, el sistema CRISPR ha sido diseñado para permitir una robusta activación de la expresión génica endógena (13). Varios componentes del sistema CRISPR se han modificado para generar un complejo mediador de activación sinérgica (SAM), que resulta en un sistema de activación de la transcripción altamente eficiente y específico (13). Uno de los componentes del complejo SAM, que está modificado, es la nucleasa Cas 9. En el sistema SAM, los dominios catalíticos de Cas 9 han sido desactivados y la dCas 9 resultante se fusiona a un dominio de activación de la transcripción (VP64). Guiado por un ARN diana específico (sgRNA), el complejo dCas 9- VP64- sgRNA tienen como objetivo una región localizada a - 200 pb del punto de inicio de la Transcripción (TSS) de genes endógenos, que regulan al alza la expresión génica (13). Para incrementar aún más la transcripción, el sgRNA ha sido modificado, añadiendo una horquilla al tetra lazo y el bucle 2 (13). Esta horquilla del sgRNA se une selectivamente a proteínas dimerizadas de la envoltura del bacteriófago MS2 (13). La fusión de las proteina p65 y MS2 a los dominios de trans- activación HSF1 permiten que la fusion proteica MS2-P65-HSF1 mejore el reclutamiento de factores de transcripción, mejorando así la potencia de la activación de los genes, mediada por dCas 9 (13). Los productos para la Activación se ofertan como Plásmidos y Partículas Lentivirales para una mejor eficiencia de la integración del Sistema SAM de Activación de la Transcripción en la célula (13).

Productos CRISP/Cas9 ofrecidos por Santa Cruz Biotechnology Inc.

Plásmido CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 Plasmid product details:

  • 20 µg, hasta 20 transfecciones
  • Plásmidos para Knockout (KO) CRISPR/Cas9 consisten en un conjunto de tres plásmidos con la nucleasa Cas9 y una guia de ARN de 20 nucleótidos (gRNA) diseñados para una máxima eficiencia del Knockout
  • Las secuencias del gRNA provienen de la biblioteca genómica GeCKO (v2) y dirigen a la proteína Cas9 para producir la rotura de la doble cadena (DSB) en el ADN genómico (11)
  • KO Plásmidos CRISPR/Cas9 se encuentran disponibles para genes humanos (h) y de ratón (m). Ejemplo de nomenclatura: p53 CRISPR/Cas9 KO Plasmids (h) para humano o p53 CRISPR/Cas9 KO Plasmids (m) para ratónCRISPR / plásmidos Cas9 KO disponibles para los genes humanos y de ratón se indican con el (h) o (m) la designación en el nombre del producto. Ejemplo: CRISPR p53 / Cas9 KO plásmidos (h) para el hombre o CRISPR p53 / Cas9 KO plásmidos (m) para ratón
  • Proporcionado como un plásmido purificado de ADN listo para la transfección

Support Products for CRISPR/Cas9 Plasmids:

  • Hay disponibles adecuados anticuerpos control
  • Ultracruz Transfection Reagent, sc-395739
  • Plasmid Transfection Medium, sc-108062
  • Control CRISPR/Cas9 Plasmid, sc-418922
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¿Cómo funcionan los plásmidos CRISPR/Cas9?

Download CRISPR / Cas9 Protocols

HDR Plasmid

HDR Plasmid description:

  • El plásmido HDR proporciona una plantilla específica para la reparación del ADN tras la DSB y debe co- transfectarse con el plásmido CRISPR/Cas9.
  • Cuando se co- transfecta con el plásmido CRISPR/ Cas 9, el plásmido HDR incorpora el gen de resistencia a Puromicina para seleccionar las células en las que la escisión de AND inducido por Cas9 ha tenido lugar.

HDR Plasmid product details:

  • 20 µg, hasta 20 transfecciones
  • Plásmido HDR específicos de diana se recomiendan para la co- transfección con Plásmido CRISPR/ Cas9 para el mismo gen y la misma especie
  • HDR Plasmid consiste en un conjunto de 2-3 plásmidos, cada uno con una plantilla para la Reparación Homóloga del ADN (HDR), correspondiente a los lugares de corte de corresponding CRISPR/Cas9 KO Plasmids
  • Cada plantilla HDR contiene dos brazos homólogos de 800 pares de bases diseñados para unirse específicamente al ADN genómico que acompaña el sitio de ruptura de la doble cadena de ADN, inducida por Cas 9
  • Cada plásmido HDR inserta un gen de resistencia a puromicina para permitir la selección de células con un knockout (KO).
  • Cada gen de resistencia a puromicina esta flanqueado por dos sitos LoxP que permiten un posterior procesamiento con el vector Cre
  • Cada plásmido HDR contiene también RFP para una confirmación por visualización de la transfección.
  • Proporcionado como un plásmido purificado de ADN listo para la transfección

Support Products for HDR Plasmids:

¿Cómo funcionan los plásmidos HDR?

Expresión Alélica

Células duploides tienen dos copias de un cromosoma, dos copias de cada gen. Estas dos formas el mismo gen, que no tienen que ser idénticas, se denominan alelos y en cada locus específico del cromosoma, un individuo posee dos alelos para el mismo gen. En una población, un alelo ocurre con mayor frecuencia y se denomina por ello alelo dominante (wild type) y es generalmente responsable del genotipo wild type. Mutaciones pueden generar nuevos alelos y cada alelo genera un nuevo fenotipo.

Como las células diploides contiene dos a lelos para la mayoría de los genes, rondas adicionales de trasfección y selección pueden ser necesarias por a obtener un Knock Out del gen diana, para producir un Knockout homozigótico en la población de células. Utilizando sólo el Plásmido CRISPR/Cas9 se produce reparación no homóloga,

Realizar un Western Blot tras la transfección con el Plásmido KO CRISPR/Cas 9 es una manera de determinar si se ha efectuado un corte bi-alélico o mono-alélico en la población de células. Aislando células individuales obtendremos colonias bi-alélicas o mono-alélicas. Una vez que estas poblaciones se encuentran en una confluencia adecuada, un Western Blot puede mostrar qué colonias tiene un knockot y cuales un knockdown. Una población con una edición bi-alélica no poseerá la proteína de interés, mientras que una población con una edición mono-alélica mostrará una reducción en la cantidad de proteína.

La co-transfección exitosa de un Plásmido específico de CRISPR/Cas9 con el Plásmido HDR (Reparación Homóloga) dará lugar a la interrupción génica dirigida y la reparación homóloga (HDR) del gen diana. Después de cotransfectar, han de seleccionarse las células que han sido modificadas con éxito con el gen de puromicina. Esta selección permitirá también la selección de una población mixta, mono-alélica y bi-alélica. El Western Blot será útil para mostrar qué colonias muestras una knockout bi-alélico.


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Vectores Cre

Cre Vector description:

  • El Vector Cre expresa la recombinasa Cre, una enzima p1 de bacteriófagos que cataliza la recombinación especifica de ADN entre dos sitios LoxP
  • When the CRISPR/Cas9 Knockout Plasmid is co-transfected with the HDR Plasmid, cells containing the edited DNA can be isolated using the selection marker inserted during homology-directed repair
  • Tras la selección, las células pueden transfectarse con el Vector Cre para eliminar el material genético incluido durante la recombinación homologa, gen de resistencia a la puromicina

Cre Vector product details:

  • 20 µg, hasta 20 transfecciones
  • Recomendado para la reparación del ADN y la selección de células modificadas satisfactoriamente por el KO plásmido CRISPR/Cas9 y Plásmido HDR
  • El Vector Cre contiene un promotor CMV para iniciar la expresión de la recombinasa Cre
  • proporcionado como un plásmido purificado de ADN listo para la transfección
  • Cre Vector, sc-418923

Support Products for Cre Vector:

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¿Cómo funciona el Vector Cre ?

Download Cre Vector Protocols

Plásmidos Doble Nickase

Double Nickase Plasmid product details:

  • 20 µg, hasta 20 transfecciones
  • Double Nickase Plasmids consisten en un par de plásmidos cada uno codificando una nucleasa Cas9 mutada D10A y una guia de ARN de 20 nucleótidos (gRNA) diseñados para una mayor especificidad que el homologo CRISPR/Cas9 KO
  • Las secuencias de gRNA tienen una diferencia de unas 20 pb para permitir un corte doble mediado por Cas9 en el ADN que imita el doble corte
  • Uno de los plásmidos contiene el gen de resistencia a puromicina para la selección y el otro el marcado GFP para confirmar visualmente la transfección
  • Plásmidos Doble Nickase se encuentran disponibles para genes humanos (h) y de ratón (m). Ejemplo de nomenclatura: p53 Plásmidos Doble Nickase (h) para humano o p53 Plásmidos Doble Nickase (m) para ratón
  • Proporcionado como un plásmido purificado de ADN listo para la transfección

Support Products for Double Nickase Plasmids:

  • Hay disponibles adecuados anticuerpos control
  • Ultracruz Transfection Reagent, sc-395739
  • Plasmid Transfection Medium, sc-108062
  • Control Double Nickase Plasmid, sc-437281
  • Puromycin dihydrochloride, sc-108071
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¿Cómo funcionan los plásmidos doble Nickase?

Download Double Nickase Protocols

Plásmidos Activadores

CRISPR/dCas9 Activation Plasmid product details:

  • 20 µg, hasta 20 transfecciones
  • Los Plásmidos Activadores CRISPR/dCas9 son sistemas mediadores de activación sinérgica (SAM), sistema de activación de la transcripción diseñado para incremetar específicamente la expresión génica.
  • Plásmidos Activadores CRISPR/Cas 9 incluyen los siguientes tres plásmidos, con un radio 1:1:1 : plásmido codificador de la nucleasa Cas 9 desactivada, (D10A y N863A) fusionadas al dominio de transactivación VP64,; plásmido codificador de la proteína de fusión MS2-p65-HSF1 y un plásmido que codifica la secuencia de diana específica de 20 nt de ARN.
  • Las secuencias de gRNA que se encuentran en el complejo mediador de activación sinérgica (SAM) CRISPR/Cas 9 proceden de bibliotecas humanas y dirigen el complejo SAM para que se una a lugares que se encuentran a 200 -250 nt aguas arriba del inicio de la transcripción del gen diana.
  • El sistema SAM proporciona un reclutamiento robusto de factores de transcripción para la activación altamente eficiente del gen diana.
  • Plásmidos Activador CRISPR/dCas9 se encuentran disponibles para genes humanos (h) y de ratón (m). Ejemplo de nomenclatura: p53 CRISPR/dCas9 Plásmidos Activador (h) para humano o p53 CRISPR/dCas9 Plásmidos Activador (m) para ratón
  • Proporcionado como un plásmido purificado de ADN listo para la transfección

Support Products for CRISPR Activation Plasmids:

  • Hay disponibles adecuados anticuerpos control
  • Ultracruz Transfection Reagent, sc-395739
  • Plasmid Transfection Medium, sc-108062
  • Control CRISPR/dCas9 Activation Plasmid, sc-437275
  • Blasticidin S HCl solution, sc-495389
  • Hygromycin B, sc-29067
  • Puromycin dihydrochloride, sc-108071
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¿Cómo funcionan los Plásmidos Activadores?

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Partículas Lentivirales de Activación

CRISPR/dCas9 Lentiviral Activation Particles product details:

  • Las Partículas Lentivirales de Activación codifican un sistema mediadores de activación sinérgica (SAM), sistema de activación de la transcripción diseñado para incrementar específicamente la expresión génica mediante la transducción con lentivirus de las células(13)
  • El complejo SAM resultante se une en un punto específico a unos 200 -250 nt aguas arriba del inicio de la transcripción del gen diana y ofrece un potente punto de reclutamiento de factores de transcripción para un eficiente incremento de la activación genica
  • Las partículas Lentivirales de Activación se suministran congeladas en 200 µl de Medio Dulbecco's Modified Eagle con 25 mM HEPES pH 7.3, encontrándose en ellos los tres CRISPR/dCas9 plásmidos activadores necesarios para una sobre- expresion del gen diana:
    1. Nucleasa Cas9 desactivada (dCas9) (D10A y N863A) fusionada con el dominio de transactivación VP64 y el gen de resistencia a blasticidina
    2. MS2-p65-HSF1 fusion protein, and hygromycin resistance genes
    3. 20 nt gARN especificos de diana y gen de resistencia a la Puromicina
  • Recomendado su uso en células difíciles de transfectar
  • Las Partículas lentivirales de Activación CRISPR/dCas9 se encuentran disponibles para genes humanos (h) y de ratón (m). Ejemplo de nomenclatura: p53 CRISPR/dCas9 Plásmidos Activador (h) para humano o p53 CRISPR/dCas9 Plásmidos Activador (m) para ratón

Support Products for CRISPR Lentiviral Activation Particles:

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¿Cómo funcionan las Partículas Lentivirales de Activación?

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Preguntas Frecuentes

  • ¿Qué ventajas tiene usar CRISPR/Cas9 en vez de ARNi?

    El sistema CRISPR/Cas 9 elimina la proteina diana modificando el ADN en lugar de utilizar un ARN de interferencia que tienen como diana el mRNA al que degrada. Una vez que el ADN genómico es modificado, el cambio es permanente.

  • ¿Porqué los investigadores prefieren usar CRISPR/Cas 9 como herramienta de edición génica en lugar de zinc-finger nucleases (ZFNs) ó TALENs?

    El sistema CRISPR/Cas 9 es más barato, más eficiente y con mayor sensibilidad.

  • ¿Cómo diseñaron las secuencias del gARN?

    SCBT utiliza un conjunto de 3 secuencias de gARN diana publicadas en GeCKO v2 library. Las secuencias publicadas han demostrado tener una alta eficiencia y pocos efectos en posiciones no deseadas.

  • ¿Me facilitais la secuencias de gARN?

    Sí, las secuencias se encuentran disponibles para clientes. Por favor, póngase en contacto con el servicio Técnico.

  • ¿Porqué el plásmido CRISPR/Cas 9 es suministrado como un conjunto de tres secuencias diana de ARN?

    Diseñamos las secuencias del plásmido CRISPR/Cas 9 como un conjunto de tres gARN para asegurar suficiente interrupción del gen

  • ¿El Plásmido HDR es también un conjunto de tres?

    Sí, cada Plásmido HDR es diseñado para que funcione con su gARN correspondiente.

  • ¿Puede utilizarse el Plásmido CRISPR/Cas 9 KO en solitario para obtener un knockout del gen?

    Sí, se va a producir Recombinación no Homóloga (NHEJ), que generará InDels, (inserciones/deleciones). InDels alteran el Marco abierto de lectura (ORF) y pueden modificar de forma significativa la secuencia de amino ácidos tras el corte de la doble cadena (DSB) o introducir un codon de terminación. InDels generadas por NHEJ pueden generar mutaciones aleatorias, por lo que el tipo y la extensión del gen dañado deben determinarse experimentalmente.

  • ¿Cómo sé si mis células han sido transfectadas satisfactoriamente con el Plásmido CRISPR/Cas 9?

    Puede analizarse la expresión de GFP para determinar la eficiencia de la transfección. Más pruebas serían necesarias para determinar el grado de knockdown.

  • ¿Cómo sé si mis células han sido transfectadas satisfactoriamente con el Plásmido HDR?

    Puede analizarse la expresión de RFP para determinar la eficiencia de la transfección. Más pruebas serían necesarias para determinar el grado de knockdown.

  • ¿Cómo sé que los genes se editaron correctamente con KO plásmido CRISPR/Cas9 y Plásmido HDR?

    Las células con una edición satisfactoria expresarán el gen de resistencia a puromicina en su ADN genómico por lo que pueden seleccionarse con puromicina.

  • ¿Cuál es la longitud del los brazos homólogos, izquierdo (LHA) y derecho (RHA), del Plásmido HDR?

    Tienen una longitud de 800 pares de bases para asegurar el alineamiento con el ADN genómico y la Recombinación Homóloga.

  • ¿Ofreceis un control CRISPR?

    Ofrecemos un control negativo, es un plásmido CRISPR/Cas 9 KO con una sola secuencia aleatoria de gARNA, Plásmido control CRISPR/Cas 9 sc-418922. La secuencia aleatoria de gARN no se unirá al ADN por lo que el complejo Cas9/ gARN no generará ninguna ruptura en el genoma.

  • ¿Qué es una secuencia PAM?

    La secuencia protospacer adjacent motif (PAM), tiene que estar presente en el extremo 3' del ADN diana, pero no en la secuencia de gARN. Para que la Cas 9 se una al ADN, la secuencia diana del ADN debe ser complementaria a la secuencia del gARN y debe estar seguida por la secuencia PAM en el extremo 3'.

  • ¿Dónde corta el complejo Cas9/ gARN el ADN?

    Cas9 corta el ADN a una distancia aproximada de 3 - 5 pares de bases aguas abajo del extremo 3' de la secuencia diana.

  • ¿El sistema CRISPR/Cas 9 funciona en células que se dividen y en células que no se dividen?

    Si. Las células que se dividen pueden realizar recombinación homóloga ó no Homóloga (NHEJ ó HDR), mientras que las células que no se dividen sufrirán sólo Recombinación no homóloga (NHEJ).

  • ¿Varía la eficiencia dependiendo de la linea celular?

    Sí, los resultados pueden variar entre lineas celulares y secuencias diana.

  • ¿Cómo puedo determinar si mi gen a sido silenciado con éxito por el sistema CRISPR/Cas 9?

    Hay más de una posibilidad para verificar el silenciamiento. La puromicina permite la selección de las células que han sido modificadas por el Plásmido HDR. Análisis por Western Blot pueden mostrar reducción en la cantidad de proteína. PCR del genoma detectará la integración. Las mutaciones pueden detectarse mediante ampliación de la secuencia del genoma, clonación del fragmento mediante PCR y secuenciación.

  • ¿Qué recomendáis para una verificación de la transfección mediante Western Blot o/y Inmunofluorescencia?

    Análisis mediante Western Blot e Inmunofluorescencia determinarán si la proteina Cas 9 se expresa. Puede utilizar el marcador RFP para detectará la fluorescencia o utilizar un anticuerpo contra Cas 9, Cas9 Antibody (7A9-3A3), sc-517386.

  • ¿Cuántos genes puedo silenciar de una vez ?

    No se ha determinado la cantidad máxima de genes que se pueden silenciar. Algunos investigadores afirman que pueden silenciarse varios genes a las vez, dependiendo de la eficacia de la co- transfección en las células. Nosotros recomendamos y garantizamos el uso de nuestros Plásmidos CRISPR/Cas 9 de uno en uno.

  • ¿Que productos complementarios y reactivos de transfección debo comprar a SCBT para utilizar sus plásmidos de CRISPR/Cas9 KO?

    Control CRISPR/Cas9 Plasmid sc-418922, Ultracruz Transfection Reagent sc-395739, Plasmid Transfection Medium sc-108062, Puromycin dihydrocholoride sc-108071. We also offer control antibodies for each target-specific CRISPR/Cas9 KO Plasmid.

  • ¿Proporcionamos productos CRISPR personalizados?

    Por favor contacte con el Servicio Técnico para más detalles.

  • ¿Cuánto tiempo tardan en enviar productos CRISPR que no se encuentran en stock?

    10-14 days

References

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