Gen Silencer

Santa Cruz Biotechnology now offers target-specific CRISPR/Cas9 Knockout (KO) Plasmids, CRISPR Double Nickase Plasmids, CRISPR/ dCas9 Activation Plasmids and CRISPR Lenti Activation Systems for over 18,910 human and 18,340 mouse protein encoding genes.

Geschichte der RNAi

Der zuerst von den Nobelpreisträgern Andrew Z. Fire und Craig C. Mello in C. elegans beschriebene Mechanismus der (1), RNA Interferenz (RNAi) ist eine der vielversprechensten Entdeckungen der neueren Molekularbiologie. Endogene RNAi-Aktivität wurde hierdurch mit der Regulierung der Transposon-Mobilität (2), der Bestimmung von Gen-Expressionsprofilen (3) und der Analyse des Zellschicksals (4) in Verbindung gebracht. In Organismen ist die RNA Interferenz eine entscheidende Komponente der angeborenen zellulären Abwehr gegen virale Infektionen (5). Bisher wurden drei unterschiedliche Wirkmechanismen der RNAi zur Kontrolle der Genexpression von Ziel-Genen beschrieben. RNAi reguliert die Transkription von Ziel-Genen zum einen durch die Beeinflussung der Heterochromatin-Entstehung (6). Zum anderen übt RNAi darüber hinaus zumindest zwei Formen post-transkriptionaler Kontrolle aus: (1)) direkte Inhibierung der Translation von Ziel-mRNA (7) und (2)) Steuerung des Abbaus der Ziel-mRNA durch den RISC-Komplex (8).

Im Labor wird RNAi eingesetzt, um die Genexpression einzelner Zielgene in einer Vielzahl von Organismen und Zelltypen herunter zu regulieren. Dies geschieht unter Verwendung aller drei bisher bekannten und bereits weiter oben beschriebenen Mechanismen zur Inhibierung der Genexpression. Alle diese Techniken sind hilfreich um die Funktion einzelner Gene zu beeinflussen und deren Zusammenspiel mit weiteren Genen und Proteinen zu untersuchen. RNAi wird neben der Grundlagenforschung auch wegen des großen klinischen Potentials weitergehend erforscht (9).

Details dieser RNAi Mechanismen sind zur Zeit weit verbreitete Themen der Grundlagenforschung, da der genaue Mechanismus und das Zusammenspiel der einzelnen Komponenten bisher noch nicht abschließend aufgeklärt werden konnten. Der durch den RISC-Komplex kontrollierte Abbau der Ziel-mRNA ist dabei der bisher am besten verstandene und im Labor verwendete Wirkmechanismus von RNAi Gen Silencern.

Santa Cruz Biotechnology, Inc. bietet eine komplette Produktreihe von RNAi Gen Silencer Reagenzien aus siRNA, shRNA Plasmiden und Lentiviralen Partikeln gegen >99% der putativ Protein-kodierenden humanen und murinen Gene an.

RNAi Produkte von Santa Cruz Biotechnology, Inc.

siRNA Gen Silencer

siRNA description:

  • siRNA bedeutet small interfering oder short interfering RNA
  • Die Transfektion der Zellen muss mit einem Lipid-basierenden Transfektionsreagenz erfolgen.
  • Für transientes Gen Silencing

siRNA product details:

  • Die angebotenen siRNAs enthalten doppelsträngige RNA mit einer Länge von jeweils 20-25 nt mit 2-nt 3' Überhängen an jedem Ende.
  • 10 µM, 50-100 Transfektionen
  • Zur unabhängigen und genaueren Überprüfung der mit unseren siRNA erhaltenen Ergebnisse zum Silencing der Gene bieten wir auf Anfrage auch gerne die enthaltenen, doppelsträngigen siRNAs separat ebenfalls als 3 nmol lyophilisierte siRNA an.

Support Products for siRNA Gene Silencers:

  • Es werden geeignete Primärantikörper zur Kontrolle angeboten
  • RT-PCR Primer
  • siRNA Dilution Buffer, sc-29527
  • siRNA Transfection Reagent, sc-29528
  • siRNA Transfection Medium, sc-36868
  • siRNA Reagent System, sc-45064
  • Control siRNAs, including Control siRNA-A, sc-37007
  • Control siRNA (FITC Conjugate)-A, sc-36869
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Wie ist die Funktionsweise der siRNA Gen Silencer?

Download siRNA Protocols

FGF-19 siRNA (h): sc-39480

CD9 siRNA (h): sc-35032

Daxx siRNA (h): sc-35178

Cdc6 siRNA (h): sc-29258

cytochrome c siRNA (h): sc-29292

cPLA2 siRNA (h): sc-29280

ERK 1 siRNA (m): sc-29308

c-Src siRNA (h): sc-29228

p53 siRNA (h): sc-29435

Lamin A/C siRNA (h): sc-35776

shRNA Plasmid Gen Silencer

shRNA Plasmid description:

  • shRNA bedeutet small hairpin oder short hairpin RNA
  • shRNA-kodierende Plasmide gelangen mittels Lipid-basierender Transfektion in die Zelle
  • shRNA Plasmid DNA hat die Fähigkeit zur transienten und stabilen Inhibierung der Expression des jeweiligen Ziel-Gens.
  • shRNA Plasmide werden als Pool (=Gemisch), bestehend aus drei bis fünf lentiviralen Vektor-Plasmiden geliefert. Die einzelnen lentiviralen Vektor-Plasmide kodieren jeweils für eine zielspezifische 19-25 nt shRNA mit einem 6 bp Loop.
  • 20 µg, bis zu 20 Transfektionen
  • shRNA Transkription wird durch den H1 Promoter gesteuert.
  • wird als transfektionsfertige, aufgereinigte Plasmid DNA geliefert
  • Stabil transfizierte, die shRNA exprimierende Zellen werden durch Zugabe von Puromycin selektiert.

Support Products for shRNA Plasmid Gene Silencers:

  • Es werden geeignete Primärantikörper zur Kontrolle angeboten
  • RT-PCR Primer
  • shRNA Plasmid Transfection Reagent, sc-108061
  • shRNA Plasmid Transfection Medium, sc-108062
  • Control shRNA Plasmid-A, sc-108060
  • Control shRNA Plasmid-B, sc-108065
  • Control shRNA Plasmid-C, sc-108066

Confirm shRNA Plasmid Gene Silencer transfection efficiency with copGFP Control Plasmid: sc-108083

Generierung von Zellen mit stabiler shRNA Expression

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Wie ist die Funktionsweise der shRNA Plasmid DNA Gen Silencer?

Download shRNA Protocols

IL-1α shRNA Plasmid (h): sc-39613-SH

PTN shRNA Plasmid (m): sc-39714-SH

TCF-4 shRNA Plasmid (h): sc-43525-SH

MIS shRNA Plasmid (h): sc-39793-SH

VEGF-D shRNA Plasmid (h): sc-39844-SH

Amylase shRNA Plasmid (h): sc-29675-SH

FGF-19 shRNA Plasmid (h): sc-39480-SH

MMP-9 shRNA Plasmid (h): sc-29400-SH

BMP-4 shRNA Plasmid (h): sc-39744-SH

Cyr61 shRNA Plasmid (h): sc-39331-SH

shRNA Lentivirale Partikel

shRNA Lentiviral Particle description:

  • shRNA bedeutet small hairpin oder short hairpin RNA
  • Lentivirale Partikel schleusen shRNA-kodierende Plasmide in die Zelle.
  • Zweckdienlich entweder für transienten oder stabilen Knock-down des Zielgens.
  • Lentivirale Partikel werden als transduktionsfertige virale Partikel zum Silencing bestimmter Gene in Säugerzellen (Human oder Maus) angeboten.
  • 200 µl virale Stammlösung enthält 106 infektiöse lentivirale Einheiten, diese Menge ist ausreichend für 10-20 Transduktionen.
  • Lentivirale Partikel werden als Pool (=Gemisch), bestehend aus drei bis fünf lentiviralen Vektor-Plasmiden geliefert. Die einzelnen lentiviralen Vektor-Plasmide kodieren jeweils für eine zielspezifische 19-25 nt shRNA, die einen 6 bp Loop enthält.
  • Zellen, die nach der Transduktion die gewünschte shRNA exprimieren, werden über die Zugabe von Puromycin selektiert.
  • Durch Zugabe von copGFP Lentiviralen Partikeln zu einer Probe der Zielzellen kann die Effizienz der viralen Transduktion für diese Zellen ermittelt werden. Die copGFP Lentiviralen Partikel führen zur Expression des grünen Fluoreszenzproteins (copGFP) welches mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflußzytomerie detektiert werden kann.
  • Die Vorteile der Verwendung von shRNA Lentiviralen Partikeln liegen zum einen darin, dass die Verwendung von störenden Transfektions-Reagenzien vermieden wird und in der Möglichkeit die shRNA in jeden gewünschten Zelltyp einzubringen.
  • Biologische Sicherheit - Diese Lentiviralen Partikel sind replikationsinkompetent und so beschaffen, dass sie sich nach der Transduktion und Integration in die genomische DNA der Wirtszelle selbst inaktivieren.

Support Products for shRNA Lentiviral Particle Gene Silencers:

  • Es werden geeignete Primärantikörper zur Kontrolle angeboten
  • RT-PCR Primer
  • Control shRNA Lentiviral Particles: sc-108080
  • copGFP Control Lentiviral Particles: sc-108084
  • Puromycin dihydrochloride: sc-108071

Generierung von Zellen mit stabiler shRNA Expression

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Wie ist die Funktionsweise der Lentiviralen Partikel?

Download Lentiviral Protocols

Verwenden Sie eine effektive Transduktionskontrolle

copGFP Kontroll-Lentivirale Partikel: sc-108084

293T cells stably transduced with copGFP Control Lentiviral Particles (sc-108084) compared with non-transduced 293T cells as a negative control.


PNP shRNA (h) Lentiviral Particles: sc-45991-V

ephrin-A1 shRNA (m) Lentiviral Particles: sc-39427-V

MCP-4 shRNA Plasmid (h): sc-72122-SH

TNFβ shRNA Plasmid (h): sc-37218-SH

Somatostatin shRNA (h) Lentiviral Particles: sc-39728-V

Fos B shRNA (h) Lentiviral Particles: sc-35403-V

Häufig gestellte Fragen (FAQs)

  • Worin bestehen die Vor- und Nachteile bei der Verwendung von shRNA bzw. siRNA?

    Die Transfektion von siRNA Gen Silencern in Zellen liefert eine schnelle und effiziente, allerdings nur relativ kurz andauernde, Möglichkeit die Expression des Ziel-Gens herunter zu regulieren. Eine länger andauernde und sogar dauerhafte Unterdrückung der Genexpression kann durch die Verwendung von shRNA Plasmiden oder shRNA Lentiviralen Partikeln mit anschließender Selektion duch Zugabe von Puromycin erreicht werden. Deshalb ist besonders bei der Untersuchung von Proteinen mit einem geringen Umsatz, die Verwendung von shRNA Plasmiden oder shRNA Lentiviralen Partikeln gegenüber der Verwendung von siRNA vorzuziehen.

  • Worin bestehen die Vor- und Nachteile bei der Verwendung von shRNA Lentiviralen Partikeln bzw. shRNA Plasmid DNA?

    Für die Verwendung von shRNA Plasmiden zur Inhibierung der Expression des Ziel-Gens muss eine Transfektion der Zellen erfolgen. Im Gegensatz hierzu werden unsere shRNA Lentiviralen Partikel transduktions-fertig geliefert. Die shRNA Lentiviralen Partikel können einfach ohne Zugabe weiterer Reagenzien zu den Zellen gegeben werden und nahezu jede Säugerzelllinie, wie z.B. Primärzellen oder sich nicht teilende Zellen transduzieren. shRNA Plasmide und shRNA Lentivirale Partikel können beide für stabile, d.h. dauerhafte Expression der shRNA verwendet werden werden wenn eine Selektion der Zellen durch Puromycin erfolgt. Lentivirale Partikel werden auf Trockeneis verschickt während der Versand von shRNA Plasmiden bei Umgebungstemperatur oder Blue Ice erfolgt .

  • Müssen bei der Verwendung von SCBT shRNA Produkten besondere Aspekte der biologischen Sicherheit berücksichtigt werden?

    Lentivirale Partikel können in gewöhnlichen S2 Zellkulturräumen (Biosafety Level 2 / Schutzstufe 2) verwendet werden (und sollten mit der selben Sorgfalt und Vorsicht verwendet werden, wie auch andere potentiell infektiöse Reagenzien)

  • Sind die verwendeten Sequenzen für die shRNA Plasmide identisch mit denen der entsprechenden siRNA gegen das gleiche Genprodukt? Sind die verwendeten Sequenzen für Kunden erhältlich?

    Ja. Die Sequenzen für die unsere shRNA Plasmide kodieren sind identisch mit denen, die in den entsprechenden siRNA Gen Silencern verwendet werden. Die Sequenzen teilen wir Kunden eines RNAi Produkts gerne auf Anfrage mit. Bitte nehmen Sie hierzu mit unserem technischen Kundendienst Kontakt auf.

  • Die shRNA Plasmide bestehen aus einem Pool (=Gemisch) aus drei bis fünf lentiviralen Vektor-Plasmiden. Werden die verschiedenen Plasmide jeweils einzeln in separaten Röhrchen oder als ein Gemisch der Sequenzen in nur einem Röhrchen geliefert?

    Die shRNA Plasmide werden als Gemisch in einem einzigen Röhrchen geliefert. Bei unseren siRNA können die individuellen Sequenzen separat bestellt werden. Bitte nehmen Sie Kontakt mit dem Technischen Service auf.

  • Welcher Typ lentiviraler Vektor wird in den SCBT Produkten verwendet? Wie lautet der "Name des Vektor"?

    Unser Lentiviraler Vektor ist ein für unsere Lentiviralen Produkte angefertigter, proprietärer Vektor. Bitte lassen Sie uns wissen, welche Details zu unserem Vektor Sie suchen und warum Sie diese benötigen. Unser technischer Kundendienst kann Ihnen vielleicht die gewünschte Auskunft geben oder Ihnen bei der Beantwortung Ihrer Fragestellung helfen, ohne dass dabei firmeninterne Information notwendig wäre.

  • Welcher Promoter wird in den Vektoren verwendet?

    Unsere Vektoren verwenden einen H1 Promoter.

  • Welcher Selektionsmarker wird in den Vektoren verwendet?

    Unsere Vektoren verwenden ein Gen für die Puromycin-Resistenz, welches für das Enzym Puromycin N-Acetyltransferase kodiert und für die Selektion von erfolgreich transfizierten (shRNA) oder transduzierten (lentivirale Partikel) Zellen genutzt wird.

  • Wie kann ich die Lentiviralen Vektor Plasmide propagieren?

    Unsere shRNA Plasmid DNA und Lentiviralen Partikel werden als transfektions- bzw. transduktionsfertige Produkte angeboten, für die keine weitere Aufbereitung erforderlich ist. Unsere shRNA Gen Silencer sind Verbrauchsprodukte, für die kein Propagationsprotokoll angeboten wird.

  • Was ist copGFP und wie wird es im Zusammenhang mit shRNA Plasmiden und Lentiviralen Partikeln verwendet?

    Durch Zugabe des copGFP Plasmids oder copGFP Lentiviraler Partikel zu einer separaten Probe der Zielzellen kann die Effizienz der Transfektion bzw. der viralen Transduktion für diese Zellen ermittelt werden. Das copGFP Plasmid oder die copGFP Lentiviralen Partikel führen zur Expression des ursprünglich aus dem Ruderfußkrebs (engl.: copepod) stammenden grünen Fluoreszenzproteins (GFP). Das grüne Fluoreszenzprotein (copGFP) kann mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie detektiert werden.

  • Worin besteht der Unterschied zwischen (h) und (h2) shRNA Produkten (z.B.: E-Cadherin, sc-35242-SH und sc-44222-SH)?

    Die (h) und (h2) Produkte werden zur Regulation des gleichen humanen Gens angeboten. Die (h) und (h2) Produkte bestehen allerdings aus verschiedenen Sequenzen bzw. verschiedenen Sequenzpools.

  • Welche Supportprodukte und Transfektions-Reagenzien bietet SCBT für die shRNA Plasmide an?

    Wie empfehlen die Verwendung unseres shRNA Plasmid DNA Transfektions-Reagenz, sc-108061 zusammen mit unserem shRNA Plasmid DNA Transfektions-Medium, sc-108062. Wie empfehlen die Verwendung unserer shRNA Kontroll-Plasmid DNAs, entweder sc-108060 (A), sc-108065 (B) oder sc-108066 (C). Diese kodieren für gescrambelte shRNA Sequenzen welche keine bisher bekannte Säuger-mRNA treffen sollten.

Literaturhinweise

  1. Fire, A., Xu, S.Q., Montgomery, M.K., Kostas, S.K., Driver, S.E. and Mello, C.C. 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811.

  2. Das, P.P., Bagijn M.P., Goldstein, L.D., Woolford, J.R., Lehrbach, N.J., Sapetschnig, A., Buhecha, H.R., Gilchrist, M.J., Howe, K.L., Stark, R., Matthews, N., Berezikov, E., Ketting, R.F., Tavaré, S. and Miska E.A. 2008. Piwi and piRNAs Act Upstream of an Endogenous siRNA Pathway to Suppress Tc3 Transposon Mobility in the Caenorhabditis elegans Germline. Mol Cell 31: 79-90.

  3. Kawasaki, H., Taira, K. and Morris, K.V. 2005. siRNA Induced Transcriptional Gene Silencing in Mammalian Cells. Cell Cycle 4: 442-448.

  4. Georgantas III, R.W., Hildreth, R., Morisot, S., Alder, J., Liu, C.G., Heimfeld, S., Calin, G.A., Croce, C.M. and Civin, C.I. 2007. CD34+ hematopoietic stem-progenitor cell microRNA expression and function: A circuit diagram of differentiation control. PNAS 104: 2750-2755.

  5. Chotkowskia, H.L., Ciotab, A.T., Jiab, Y., Puig-Basagoitic, F., Kramerb, L.D., Shic, P.Y. and Glaser, R.L. 2008. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology 377: 197-206.

  6. Kawasaki, H., Taira, K. and Morris, K.V. 2005. siRNA Induced Transcriptional Gene Silencing in Mammalian Cells. Cell Cycle 4: 442-448.

  7. Tamura, Y., Yoshida, M., Ohnishi, Y. and Hohjoh, H. 2008. Variation of gene silencing involving endogenous microRNA in mammalian cells. Mol Biol Rep, epub.

  8. Hammond,S.M., Boettcher, S., Caudy, A.A., Kobayashi, R. and Hannon, G.J. 2001. Argonaute2, a Link Between Genetic and Biochemical Analyses of RNAi. Science 293: 1146-1150.

  9. Zhanga, Y., Yanga, H., Xiaoa, B., Wub, M., Zhoua, W., Lia, J., Lib, G. and Christados, P. 2008. Dendritic cells transduced with lentiviral-mediated RelB-specific ShRNAs inhibit the development of experimental autoimmune myasthenia gravis. Mol Imunol, epub.

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