CRISPR Systeme

Santa Cruz Biotechnology now offers target-specific CRISPR/Cas9 Knockout (KO) Plasmids, CRISPR Double Nickase Plasmids, CRISPR/ dCas9 Activation Plasmids and CRISPR Lenti Activation Systems for over 18,910 human and 18,340 mouse protein encoding genes.

Geschichte von CRISPR/Cas9

Die CRISPR/Cas-System ist ein von Archaeen und Bakterien verwendeter adaptiver Abwehrmechanismus ähnlich eines Immunsystems zum Abbau von fremden genetischem Material. In diesen Organismen wird von Phagen injiziertes genetisches Material in spezielle CRISPR Loci integriert (1,2). Das neue Genmaterial, auch Spacer genannt, erzeugt ein sequenzspezifisches Fragment welches zur Erkennung einer zukünftigen Phageninfektion verwendet werden kann. Dazu werden die Spacer in kurze CRISPR RNAs (crRNAs) translatiert. Diese fungieren als Orientierungshilfe für den spezifischen Abbau der komplementären Phagen DNA durch die Nuklease Cas, welche ebenfalls auf dem CRISPR Locus kodiert wird (1,2). Pre-crRNA bindet tracrRNA (trans-activierende crRNA) und der RNA-Duplex wird von RNAse III prozessiert. Der entstandende crRNA/tracrRNA-Hybrid, geht als gRNA einen Komplex mit der Cas9 Nuklease ein. Dies geschieht indem sie an die Brückenhelix im REC Bereich des Enzyms bindet und das Rückgrat der crRNA zahlreiche Salzbrücken mit dem Protein ausbildet (1,2,3). Die Cas9 Nuklease des Typ II CRISPR Systems verfügt über eine RNA Bindedomäne, einen Bereich zur Erkennung von Alpha-Helizes, eine Domäne mit Endonuklease-Aktivität sowie eine Domäne zur Erkennung von "protospacer adjacent motif" (PAM) Elementen der DNA (1,2). CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) sind DNA-Abschnitte mit gleichmäßig verteilter, sich wiederholender DNA-Sequenz, die von vorn und von hinten abgelesen, gleich lautend sind.

Sobald die crRNA an Cas9 gebunden ist, verändert das Enzym seine Konformation und bildet einen Kanal für die Bindung an die DNA (1,2,3). Der Cas9/crRNA Komplex durchsucht dann die DNA nach PAM Elementen (4,5,6). Bei Erkennen eines PAM Elements wird die DNA entspannt, und die crRNA kann die benachbarte Sequenz auf Komplementarität überprüfen. Sobald Cas9 an das PAM Element neben der crRNA-komplementären DNA Sequenz gebunden hat, bildet die Brückenhelix im REC Bereich des Enzyms einen DNA-RNA Heteroduplex mit dem Zielgen (3,4,7). Das Erkennen des PAM Elements durch Cas9 aktiviert die nukleolytischen HNH und RuvC Domänen des Enzyms, welche einen Doppelstrangbruch (DSB) in der DNA-Zielsequenz verursachen. Dies führt zum Abbau der betroffenen DNA (1,2,5,8). Falls die vorhandene crRNA nicht komplementär zur DNA an dieser Position ist, verlässt Cas9 seine Position wieder und sucht nach einem anderen PAM Element (7). Ein entstandener Doppelstrangbruch in der DNA kann mittels nicht-homologer Endverknüpfung (NHEJ) geschlossen werden, welche durch zufälliges Einfügen oder Entfernen (InDels) von Nukleotiden Fehler in der genetischen Information erzeugt (Punktmutation). Alternativ ist eine homologe Rekombination (HR bzw. HDR) möglich. Bei diesem Mechanismus können beliebige Gene, z.B. auch Selektionsmarker an der entsprechenden Stelle im Genom eingebaut werden (2,9,10). Der CRISPR/Cas9 Mechanismus kann für die genomische Modifikation von verschiedenen Systemen, einschließlich Säugerzellen, umfunktioniert werden.

Gene-Editing mittels Doppelstrangbrüchen kann mit Hilfe von sog. Designer-Nukleasen wie Meganukleasen, Zinkfingernukleasen (ZFNs = Zink-Finger-Nukleases) oder Transkriptionsaktivator-ähnlichen Effektornukleasen (TAL-Effektoren oder TALENs = Transcription Activator-like Effector Nucleases) erfolgen. Jedoch gibt es bei diesen Methoden Einschränkungen. Bei der Verwendung von Meganukleasen lässt sich eine spezifische Erkennung der Zielsequenz vom Enzym nur schwer nachweisen. ZFNs und TALENs unterscheiden sich in der Beschaffenheit der DNA-Bindedomänen. Beide sind schwierig zu designen und beide erkennen maximal eine kurze Zielsequenz von 3nt Länge. Bei CRISPR/Cas9 hingegen lassen sich einzelne guide RNAs (sgRNAs) relativ einfach designen. Diese gRNAs übernehmen in den K/O Experimenten die Funktion der in der Natur vorkommenden crRNAs. Sie können zur zielgerichteten Modifikation von DNA Loci parallel zur Cas9 Nuklease vom selben Vektor expremiert werden. Das CRISPR/Cas9 System verfügt außerdem über eine höhere Sensitivität und es ist im Screening effizienter als small hairpin RNAs. Für die Anwendung in Säugerzellen wird heute von vielen Laboren das CRISPR/Cas9 System bevorzugt.

Ein deutlicher Vorteil des CRISPR/Cas9 Systems ist die hohe Effizienz bei der Erzeugung eines Dopplestrangbruches in der genomischen DNA. Aufgrund verschiedener off-target Effekte kann die beschrieben hohe Effizienz des CRISPR/Cas9 Systems zu einer reduzierten Spezifität führen. Eine deutlich höhere Spezifität kann durch den Einsatz des CRISPR Double Nickase Systems erreicht werden. Double Nickase Plasmide nutzen Plasmidpaare die für eine Nickase (Cas9n) kodieren (eine D10A mutierte Cas9 Nuklease) sowie je eine unterschiedliche zielspezifische single guide RNA (sgRNA) Sequenz (12). Der Cas9n/sgRNA-Komplex erzeugt einen Einzelstrangbruch der Ziel-DNA komplementär zur jewiligen sgRNA-Vorlage (12). Die Zielsequenzen der sgRNA liegen ca. 20 Basenpaare auseinander und richten sich gegen jeweils einen der beiden gegenüberliegenden Stränge der Ziel-DNA. Die räumliche Trennung der DNA-Einzelstränge durch den Cas9n/sgRNA-Komplex verhindert eine Reparatur anhand des jeweiligen Komplementärstranges. Der so erzeugte zweifache Einzelstrangbruch (Double Nick) ahmt damit im Resultat den Effekt eines Doppelstrangbruchs nach (12). Der Einsatz von sgRNA-Paaren erlaubt eine erhöhte Spezifität des Cas9-vermittelten Gen-Editing bei gleichzeitig hoher Effizient (12).

Das CRISPR System wurde im Labor ursprünglich für Gene-Editing eingesetzt. Eine Weiterentwicklung ermöglicht nun die ebenso einfache wie schnelle Aktivierung der Genexpression (13). Verschiedene Komponenten des CRISPR Systems wurden verändert, um einen Mediator-Komplex zur synergistischen Gen-Aktivierung (SAM-Komplex; synergistic activation mediator complex) zu erschaffen. Das Resultat ist ein hoch spezifisches und effizientes System zur Transkriptionsaktivierung (13). Ein Bestandteil des SAM-Komplex ist die veränderte Cas9 Endonuklease. Eine in den katalytischen Domänen deaktivierte dCas9 wurde mit der Transkriptionsaktivierungsdomäne VP64 fusioniert. Gebunden an zielsequenz-spezifische guide RNA (sgRNA), bindet der Komplex aus dCas9-VP64-sgRNA die -200bp Region vom Transkriptionsstartsignal des endogenen Zielgens um dessen Expression hoch zu regulieren (13). Um die Aktivierung der Transkription des Zielgens noch weiter zu stiegern wurde die sgRNA dahin gehend verändert, dass ein kleiner Hairpin Aptamer am Tetraloop und Stem loop 2 angehängt wurde (13). Ein Aptamer ist ein kurzes einzelsträngiges Oligonukleotid, welches über die 3D-Struktur Moleküle binden kann. Dieser der sgRNA hinzu gefügte Aptamer bindet selektiv demerisiertes Bakteriophagen-Hüllprotein MS2 (13). Das MS2 wurde fusioniert mit den p65 und HSF1 Transaktivierungsdomänen. Das resultierende Fusionsprotein MS2-P65-HSF1 erhöht die Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren und verstärkt dadurch die Wirkung der dCas9-vermittelten Genaktivierung (13). Produkte für die Aktivierung der Genexpression werden sowohl als Standard-Plasmide für die Transfektion als auch als Lentiviral-Plasmide für eine effiziente Einschleusung des SAM-Komplex in alle Zelltypen (13).

CRISP/Cas9 Produkte von Santa Cruz Biotechnology, Inc.

CRISPR/Cas9 Plasmide

CRISPR/Cas9 Plasmid product details:

  • 20 µg, bis zu 20 Transfektionen
  • CRISPR/Cas9 Knockout (KO) Plasmide werden als Gemisch (=Pool), bestehend aus drei verschiedenen Vektor-Plasmiden geliefert. Die einzelnen Vektor-Plasmide kodieren jeweils für die Cas9 Endonuklease und für je eine zielspezifische 20nt guide RNA (gRNA) für maximale Knockout-Effizienz.
  • gRNA Sequenzen wurden aus der GeCKO (v2) Bibliothek abgeleitet. Sie leiten das Cas9 Protein zum entsprechenden Zielgen, wo das Enzym einen spezifischen Doppelstrangbruch (DSB) der genomischen DNA verursacht.
  • CRISPR/Cas9 KO Plasmide sind für alle Protein-kodierenden humanen und murinen Gene verfügbar, gekennzeichnet durch (h) oder (m) im Produktnamen. Beispielsweise: p53 CRISPR/Cas9 KO Plasmids (h) sc-416469 für das humane p53 Gen oder für das p53 Mausgen (m) sc-423509.
  • Wird als transfektionsfertige, aufgereinigte Plasmid DNA geliefert

Support Products for CRISPR/Cas9 Plasmids:

  • Es werden geeignete Primärantikörper zur Kontrolle angeboten
  • Ultracruz Transfection Reagent, sc-395739
  • Plasmid Transfection Medium, sc-108062
  • Control CRISPR/Cas9 Plasmid, sc-418922
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Wie funktioniert das CRISPR/Cas9 Plasmid?

Download CRISPR / Cas9 Protocols

HDR Plasmid

HDR Plasmid description:

  • HDR Plasmide liefern eine spezifische Matrize zur homologen Rekombination (HR bzw. HDR "homology directed repair" ) für die DNA-Reparatur nach einem von Cas9 induzierten Doppelstrangbruch (DSB). Der Einsatz von HDR-Plasmiden setzt die Co-Transfektion mit dem entsprechenden KO Plasmid voraus.
  • Bei einer Co-Transfektion mit dem CRISPR/Cas9 KO Plasmid baut das HDR Plasmid ein Puromycin-Resistenzgen als Selektionsmarker in den von Cas9 verursachten DNA Doppelstrangbruch ein.

HDR Plasmid product details:

  • 20 µg, bis zu 20 Transfektionen
  • Zielspezifische HDR Plasmide zur homologen Rekombination werden angeboten für die gleichzeitige Co-Transfektion mit dem entsprechenden CRISPR/Cas9 KO Plasmid gegen das selbe Gen und für die selbe Spezies (human / murin). Die Produkte targen die gleiche Katalognummer plus jeweils -HDR. Zum Beispiel für p53 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (human) sc-416469 sowie sc-416469-HDR und für p53 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (murin) sc-423509 sowie sc-423509-HDR.
  • HDR Plasmid wird als Gemisch, bestehend aus zwei bis drei Vektor-Plasmiden geliefert. Die einzelnen Vektor-Plasmide kodieren jeweils für eine zielspezifische Matrize zur homologen Rekombination (HDR) der entsprechenden corresponding CRISPR/Cas9 KO Plasmids Schnittstelle.
  • Jede HDR Matrize kodiert für zwei 800 bp Homologiearme. Diese binden spezifisch an die umliegende genomische DNA des entsprechenden von Cas9 verursachten DNA Doppelstrangbruchs (DSB).
  • Das HDR Plasmid enthält ein Puromycin-Resistenzgen zur Selektion von stabilen Knockout-Zellen mittels Puromycin dihydrochlorid (CAS 58-58-2) sc-108071, erhältlich als Gebinde zu je 25 mg, 50mg, 250mg oder 1g.
  • Das Puromycin-Resistenzgen wird von zwei LoxP Elementen flankiert, die eine Weiterverarbeitung durch den Cre Vektor sc-418923 ermöglichen.
  • Jedes HDR Plasmid enthält außerdem RFP (Red Fluorescent Protein) zur mikroskopischen Kontrolle der Transfektion.
  • Wird als transfektionsfertige, aufgereinigte Plasmid DNA geliefert

Support Products for HDR Plasmids:

Wie funktionieren die HDR Plasmide?

Monoallelische und biallelische Gen-Expression

Diploide Zellen enthalten im Kern zwei homologe Kopien pro Chromosom, die ihrerseits je zwei Kopien pro Gen tragen. Diese beiden Formen des Gens, die nicht zwingend identisch sein müssen, bezeichnet man als Allele. An jedem chromosomalen Locus sind also zwei alternative Allele für jedes Gen vorhanden. In einer Population wird in der Regel ein bestimmtes Allel weit häufer abgelesen. Dieses Allel wird als dominanter Wildtyp des Gens bezeichnet. Dieses Wildtyp-Allel ist verwantwortlich für den beobachteten Phänotyp. Durch Mutationen entstehen neue Allele, die jeweils zu einer Veränderung des Phänotyps führen können.

Bei der Transfektion von diploiden Zellen mit dem CRISPR/Cas9 Knockout Plasmid kommt es in der Zelle bei der Reparatur des Doppelstrangbruchs zu nicht-homologer Endverknüpfung (NHEJ) und evtl. zum Einfügen von Indels in das Gen. Da diploide Zellen für die meisten Gene zwei Allele tragen wird bei einigen Zellen nur ein Allel vom Doppelstrangbruch betroffen sein während bei anderen Zellen beide Allele betroffen sind. Die erfolgreich mit CRISPR/Cas9 transfizierte Zellpopulation umfasst somit sowohl Zellen mit einem Knockout eines Einzelallels als auch solche mit einem Knockout des Allelenpaars. Bei alleiniger Verwendung des CRISPR/Cas9 Knockout Plasmids ohne des dazu gehörenden HDR Plasmids sind dann evtl. mehrere Transfektionen und Selektionsrunden notwendig um eine Zellpopulation mit einem homozygoten Knockout zu gewinnen.

Mit Hilfe der Isolation einer Einzelzellkolonie können Sie eine homogene Population von Zellen heranziehen die entweder den Knockout nur eines Allels oder den Knockout beider Allele tragen. Nach dem Heranwachsen der Kultur bis zur Konfluenz kann im Western Blot überprüft werden ob es sich in der jeweiligen Einzelkolonie der Zelle um einen mono- oder biallelischen Knockout des Zielgens handelt. Bei Zellen mit einem biallelischen Knockout beträgt der Knockout 100%, während bei einem monoallelischen Knockout das Protein in der Zelle meist noch deutlich nachweisbar ist.

Die erfolgreiche Co-Transfektion des CRISPR/Cas9 Knockout Plasmids mit dem enstprechenden HDR-Plasmid führt nach einem Doppelstrangbruch zur homologer Rekombination (HR) des Zielgens und der EInfügung der Puromycin-Resistenz. Nach erfolgreicher Co-Transfektion können die Zellen daher mittels Puromycin selektiert werden. Die Selektion wird ebenfalls eine Mischpopulation aus Zellen mit mono- oder biallelischen Knockout des Zielgens hervorbringen. Die Subklonierung und Durchführung eines Western Blots ist auch hier notwendig um zu identifizieren welche der Kolonien den gewünschten kompletten biallelischen 100% Knockout trägt.


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Cre Vektor

Cre Vector description:

  • Der Cre Vektor exprimiert die Cre Rekombinase, ein Enzym des Bakteriophagen P1 welches die spezifische DNA Rekombination zwischen zwei LoxP Elementen ("locus of crossover in phage P1") katalysiert.
  • When the CRISPR/Cas9 Knockout Plasmid is co-transfected with the HDR Plasmid, cells containing the edited DNA can be isolated using the selection marker inserted during homology-directed repair
  • Nach der erfolgreichen Selektion können die Zellen anschließend mit dem Cre-Vektor transfiziert werden, um das zusätzlich eingebrachte genetische Material (u.a. den Selektionsmarker Puromycin-Resistenzgen) wieder herauszuschneiden. Diese Zellen können weiter kultiviert werden und z.B. durch andere CRISPR/Cas9 KO und HDR Plasmide weiter genetisch verändert werden. Dieser Zyklus lässt sich auch mehrfach wiederholen.

Cre Vector product details:

  • 20 µg, bis zu 20 Transfektionen
  • Empfohlen für die DNA-Reparatur in Zellen die erfolgreich mit dem CRISPR/Cas9 KO Plasmid und dem HDR Plasmid modifiziert wurden.
  • Der Cre Vektor enthält einen CMV Promotor zur Expression der Cre Rekombinase.
  • Wird als transfektionsfertige, aufgereinigte Plasmid DNA geliefert
  • Cre Vector, sc-418923

Support Products for Cre Vector:

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Wie funktioniert der Cre Vektor?

Download Cre Vector Protocols

Double Nickase Plasmide

Double Nickase Plasmid product details:

  • 20 µg, bis zu 20 Transfektionen
  • Das Double Nickase Plasmids wird als Plasmid-Paar geliefert. Die einzelnen Plasmide kodieren für eine D10A mutierte Cas9 Nuklease, sowie je eine unterschiedliche zielspezifische 20nt guide RNA (gRNA) Sequenz. Dies erlaubt eine hohe Knockout-Effizienz bei gleichzeitig größerer Spezifität als das entsprechende CRISPR/Cas9 KO Plasmid.
  • gRNA Sequenzpaare liegen ca. 20 bp auseinander um eine spezifisches Cas9-vermitteltes double nicking der genomischen DNA zu erlauben und so im Resultat den Effekt eines Doppelstrangbruchs nachzuahmen.
  • Ein Plasmid kodiert für ein Puromycin-Resistenzgen zur Selektion von stabilen Knockout-Zellen. Das andere Plasmid kodiert für ein GFP-Gen für den visuellen Nachweis der Transfektion
  • Double Nickase Plasmide sind für alle Protein-kodierenden humanen und murinen Gene verfügbar, gekennzeichnet durch (h) oder (m) im Produktnamen. Beispielsweise: p53 Double Nickase Plasmid (h) für das humane p53 Gen oder für das p53 Mausgen p53 Double Nickase Plasmid (m) .
  • Wird als transfektionsfertige, aufgereinigte Plasmid DNA geliefert

Support Products for Double Nickase Plasmids:

  • Es werden geeignete Primärantikörper zur Kontrolle angeboten
  • Ultracruz Transfection Reagent, sc-395739
  • Plasmid Transfection Medium, sc-108062
  • Control Double Nickase Plasmid, sc-437281
  • Puromycin dihydrochloride, sc-108071
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Wie funktionieren die Double Nickase Plasmide?

Download Double Nickase Protocols

Aktivierungs-Plasmide

CRISPR/dCas9 Activation Plasmid product details:

  • 20 µg, bis zu 20 Transfektionen
  • CRISPR/dCas9 Aktivierungs-Plasmide sind ein SAM-Komplex (Mediator-Komplex zur synergistischen Gen-Aktivierung) gesteuertes System zur Transkriptionsaktivierung eines gewünschten Zielgens mit einer daraus resultierenden erhöhten Genexpression.
  • CRISPR/dCas9 Aktivierungs-Plasmide enthalten ein Gemisch aus 3 Plasmiden mit dem Masseverhältnis 1:1:1; Plasmid eins kodiert für die deaktivierte dCas9 Nuklease (D10A und H840A) fusioniert an die Transaktivierungsdomäne VP64; Plasmid zwei kodiert für das Fusionsprotein MS2-p65-HSF1; Plasmid drei kodiert für die zielspezifische 20nt guide RNA.
  • gRNA-Sequenzen wurden aus der CRISPR/Cas9 SAM-Library ausgewählt. Diese gRNA führen den SAM-Komplex zu einer sequenzspezifischen Region 200-250 nt upstream (in 5´-Richtung) des Transkriptionsstartsignals des Zielgens.
  • Der SAM-Komplex rekrutiert Transkriptionsfaktoren und führt effizient zur Aktivierung und Expression des gewünschten Zielgens.
  • CRISPR/dCas9 Aktivierungs-Plasmide sind für alle Protein-kodierenden humanen und murinen Gene verfügbar, gekennzeichnet durch (h) oder (m) im Produktnamen. Beispielsweise: p53 CRISPR/dCas9 Aktivierungs-Plasmid (h) für das humane p53 Gen und für das p53 Mausgen p53 CRISPR/dCas9 Aktivierungs-Plasmid (m).
  • Wird als transfektionsfertige, aufgereinigte Plasmid DNA geliefert

Support Products for CRISPR Activation Plasmids:

  • Es werden geeignete Primärantikörper zur Kontrolle angeboten
  • Ultracruz Transfection Reagent, sc-395739
  • Plasmid Transfection Medium, sc-108062
  • Control CRISPR/dCas9 Activation Plasmid, sc-437275
  • Blasticidin S HCl solution, sc-495389
  • Hygromycin B, sc-29067
  • Puromycin dihydrochloride, sc-108071
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Wie funktionieren Aktivierungs-Plasmide?

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Lentivirale Aktivierungs-Partikel

CRISPR/dCas9 Lentiviral Activation Particles product details:

  • CRISPR/dCas9 Lentiviral Aktivierungs-Partikel sind SAM-Komplex (Mediator-Komplex zur synergistischen Gen-Aktivierung) gesteuertes System zur Transkriptionsaktivierung eines gewünschten Zielgens mit einer daraus resultierenden erhöhten Genexpression mittels Lentiviraltransduktion (13)
  • Der SAM-Komplex (Mediator-Komplex zur synergistischen Gen-Aktivierung) bindet eine sequenzspezifische Region 200-250 nt upstream (in 5´-Richtung) des Transkriptionsstartsignals und rekrutiert dort ständig Transkriptionsfaktoren für eine verstärkte Gen-Antivierung und Gen-Expression.
  • Lentivirale Aktivierungs-Partikel werden angeboten in 200 µl, gefrorenem Dulbecco's Modified Eagle Medium mit 25 mM HEPES pH 7,3. Sie beinhalten die notwendigen drei CRISPR/dCas9 Aktivierungsplasmide, die für ein verstärkte Antivierung und Expression des Zielgens erforderlich sind:
    1. Deaktivierte dCas9 Nuklease (D10A und H840A) fusioniert an VP64 sowie ein Blasticidin-Resistenzgen
    2. MS2-p65-HSF1 fusion protein, and hygromycin resistance genes
    3. Target-Spezifische 20 nt. guide RNA, und Puromycin-Resistenzgen
  • Empfohlen für die Anwendung für schwierig zu transfizierende Zellen
  • CRISPR/dCas9 Lentivirale Aktivierungs-Partikel sind für alle Protein-kodierenden humanen und murinen Gene verfügbar, gekennzeichnet durch (h) oder (m) im Produktnamen. Beispielsweise: p53 CRISPR/dCas9 Lentivirale Aktivierungs-Partikel (h) für das humane p53 Gen und für das p53 Mausgen p53 CRISPR/dCas9 Lentivirale Aktivierungs-Partikel (m).

Support Products for CRISPR Lentiviral Activation Particles:

  • Control Lentiviral Activation Particles, sc-437282
  • Polybrene®, sc-134220
  • Blasticidin S HCl solution, sc-495389
  • Hygromycin B, sc-29067
  • Puromycin dihydrochloride, sc-108071
  • Es werden geeignete Primärantikörper zur Kontrolle angeboten
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Wie funktionieren Lentivirale Aktivierungs-Partikel?

Download Lentiviral Protocols

Häufig gestellte Fragen (FAQs)

  • Worin bestehen die Vor- und Nachteile bei der Verwendung von CRISPR/Cas9 bzw. RNAi?

    Das CRISPR/Cas9 System verursacht einen Knockout (K/O) durch die gezielte Veränderung der Zell-DNA. Der entstandene K/O ist dauerhaft. Durch RNA Interferenz wird lediglich die mRNA abbaut und regelmäßig ein Knockdown erreicht. Die Zell-DNA wird nicht verändert.

  • Warum bevorzugen viele Forscher das CRISPR/Cas9 System im Vergleich zu ZFNs oder TALENs?

    Das CRISPR/Cas9 System ist preiswerter, es kann zielgerichteter eingesetzt werden, es hat eine höhere Effizienz und größere Sensitivität. Das CRISPR/Cas9 System wird vor allem für den Einsatz auf Säugerzellen von vielen Laboren bevorzugt.

  • Wie wurden die gRNA Sequenzen erstellt?

    Santa Cruz Biotechnology nutzt ein Gemisch (=Pool) aus 3 genspezifischen gRNA Sequenzen. Diese wurden publiziert in der GeCKO v2 library. Die hohe Effizienz bei der Modifikation der Zielsequenz und geringe unspezifische Bindungen dieser publizierten Sequenzen wurde bereits nachgewiesen.

  • Geben Sie die gRNA Sequenzen an?

    Ja, wir stellen Kunden diese Sequenzen zur Verfügung. Bitte kontaktieren Sie unseren Technischen Service in Heidelberg.

  • Warum besteht das CRISPR/Cas9 KO Plasmid aus einem Gemisch aus drei RNA Sequenzen?

    Wir haben unsere CRISPR/Cas9 Plasmide als Gemisch aus drei gRNA Sequenzen entworfen um eine vollständign Knockout des gewünschten Gens zu gewährleisten.

  • Besteht das HDR Plasmid auch aus einem Gemisch aus drei Sequenzen?

    Ja, jedes der drei im Gemisch enthaltenen HDR Plasmide wurde passend zu den drei korrespondierenden gRNA entworfen.

  • Um einen Gen-Knockout zu erreichen, ist die Verwendung des CRISPR/Cas9 KO Plasmids alleine ausreichend oder empfehlen Sie immer auch die Verwendung des zugehörigen -HDR Plasmids?

    Die Verwendung nur des CRISPR/Cas9 KO Plasmids alleine führt zu nicht-homologer Endverknüpfung (NHEJ), welche das Einfügen oder Entfernen von Nukleotiden (InDels) zur Folge haben kann. InDels verändern den offenen Leserahmen (ORF) des Gens und können die Aminosäuresequenz hinter der Doppelstrangbruch (DSB) abändern oder ein vorzeitiges Stoppcodon einfügen. Durch NHEJ verursachte InDels können zu zufälligen Mutationen führen, daher muss die Art und der Grad der verursachten Genveränderung experimentell ermittelt werden.

  • Wie finde ich heraus ob meine Zellen erfolgreich mit dem CRISPR/Cas9 KO Plasmid transfiziert wurden?

    Die Transfekionseffizienz kann mit Hilfe der GFP-Expression in den Zellen ermittelt werden. Dies kann direkt mikroskopisch oder mittels eines anti-GFP Antikörpers in verschiedenen Experimenten (WB, IF) erfolgen. Zur Überprüfung der Effizienz des K/O sind weitere Untersuchungen notwendig. Dies kann molekularbiologisch oder mittels eines Antikörpers gegen das Zielprotein erfolgen.

  • Wie finde ich heraus ob meine Zellen erfolgreich mit dem HDR Plasmid transfiziert wurden?

    Die Transfekionseffizienz kann mit Hilfe der RFP-Expression in den Zellen direkt mikroskopisch ermittelt werden. Zur Überprüfung der Effizienz des Herunterregulierung des Gens/ Proteins sind weitere Untersuchungen notwendig.

  • Woran kann ich erkennen, dass die CRISPR/Cas9 KO Plasmide und das HDR Plasmid erfolgreich die DNA modifiziert haben?

    Erfolgreich modifizierte Zellen enthalten ein Puromycin-Resistenzgen in ihrer genomischen DNA, so das eine Selektion mit Puromycin dihydrochlorid (CAS 58-58-2) sc-108071 möglich ist.

  • Wie lang sind der linke Homologiearm (LHA) und der rechte Homologiearm (RHA) des HDR Plasmids?

    Die Länge der Homologiearme beträgt 800 bp um eine spezifische und stabile Bindung mit der genomischen DNA für die homologe Rekombination zu gewährleisten.

  • Welche CRISPR/Cas9 Kontrollen bieten Sie an?

    Wir bieten eine Negativkontrolle an: Das CRISPR/Cas9 KO Kontroll-Plasmid sc-418922 enthällt drei Nonsense gRNA Sequenzen. Diese Nonsense gRNA Sequenzen binden nicht an Zielsequenz der Zell-DNA. Der Cas9/gRNA Komplex kann somit nicht binden und keinen Doppelstrangbruch verursachen.

  • Was ist eine PAM Sequenz?

    Die PAM Sequenz ("protospacer adjacent motif") ist ein dem Protospacer benachbartes Sequenzmotiv (5'-NGG). Dieses Motiv muss am 3`Ende der Zell-DNA Zielsequenz vorliegen. Wenn der Cas9/gRNA Komplex ein PAM findet, wird die benachbarte DNA auf Komplementarität geprüft. Wenn Komplementarität besteht, bindet der Cas9/gRNA Komplex und verursacht einen DNA Doppelstrangbruch. Damit also Cas9 erfolgreich an die Zell-DNA binden und einen DSB verursachen kann, muss die Zell-DNA komplementär zur Sequenz der gRNA sein und außerdem ein PAM Motiv an deren 3`Ende vorhanden sein.

  • Wo schneidet der Cas9/gRNA Komplex die DNA?

    Cas9 schneidet die genomische DNA etwa 3-5 Basenpaare nach ("downstream" ) des 3’ Endes der Zielsequenz.

  • Funktioniert das CRISPR/Cas9 System sowohl bei teilenden als auch bei nicht-teilenden Zellen?

    Ja. Sich teilende Zellen können jedoch sowohl den NHEJ- als auch den HDR Mechanismus nutzen. Sich nicht-teilende Zellen betreiben ausschließlich den NHEJ.

  • Gibt es Unterschiede in der Effizienz bei verschiedenen Zelllinien?

    Ja. Das Ergebnis variiert in Abhängigkeit der verwendeten Zelllinie und Zielsequenz.

  • Wie kann ermittelt werden ob das entsprechende Gen erfolgreich durch das CRISPR/Cas9 System herunter reguliert wurde?

    Es gibt mehrere Möglichkeiten den Knockdown nachzuweisen. Die Selektion mit Puromycin zeigt die erfolgreiche Bearbeitung der DNA mit dem HDR Plasmid. Die Herunterregulierung des Proteins kann mittels Western Blot überprüft werden. Eine PCR weist die Integration des Puromycin Gens ins Genom nach. Mögliche Mutationen des Zielgens können durch Amplifikation der Gensequenz mit anschließender Klonierung und Sequenzierung des PCR Fragments detektiert werden.

  • Empfehlen Sie die Überprüfung der Transfektion durch Western Blot und/oder Immunofluoreszenz?

    Die Expression der Cas9 Nuklease kann mittels eines anti-Cas9 Antikörpers im Western Blot oder der Immunfluoreszenz überprüft werden. Die Expression von GFP oder RFP kann direkt mikroskopisch erfolgen oder mittels eines Antikörpers im Westernblot, z.B. GFP Antikörper (B-2): sc-9996.

  • Wieviele Gene kann ich auf einmal ausschalten?

    Die maximale Anzahl verschiedener Gene einer Zelle die durch diese Methode gleichzeitig ausgeschaltet werden können ist nicht bekannt. Dies hängt auch davon ab, wie gut Ihre Zellen mit der Transfektion zurecht kommen. Es gibt bereits Untersuchungen bei denen mehrere Gene zusammen ausgeschaltet wurden. Wenn die gleichzeitige Transfektion nicht erfolgreich sein sollte, können alternativ die Zellen nach Nutzung des Cre Vektors (durch die Entfernung des eingefügten Selektionsmarkers) auch erneut mit einem CRISPR/Cas9 KO behandelt werden.

  • Welche Supportprodukte und Transfektions-Reagenzien bietet SCBT für die CRISPR/Cas9 KO Plasmide an?

    Control CRISPR/Cas9 Plasmid sc-418922, Ultracruz Transfection Reagent sc-395739, Plasmid Transfection Medium sc-108062, Puromycin dihydrocholoride sc-108071. We also offer control antibodies for each target-specific CRISPR/Cas9 KO Plasmid.

  • Können wir CRISPR Produkte auch nach Kundenwunsch anfertigen?

    Bitte sprechen Sie über Ihr Wunschprodukt mit unserem Technischen Kundendienst in Heidelberg, Deutschland.

  • Wie lange beträgt die Lieferzeit für noch nicht lagerhaltige CRISPR/Cas9 Plasmide?

    10-14 days

References

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