ZnT-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403094-ACT

SLC30A1 codifica ZnT-1, un trasportatore di efflusso dello zinco localizzato prevalentemente sulla membrana plasmatica, che mantiene l’omeostasi dello zinco citosolico esportando Zn2+ e limitando la tossicità intracellulare dello zinco. Regolando le riserve di zinco labile, ZnT-1 influenza la segnalazione dipendente dai metalli, le risposte allo stress ossidativo e l’attività di enzimi e fattori di trascrizione che richiedono zinco, incidendo così su vie più ampie di proteostasi e di adattamento allo stress. Alterazioni nella gestione dello zinco e nell’espressione di SLC30A1 sono state collegate alla suscettibilità cellulare al sovraccarico di metalli e allo squilibrio redox, processi implicati nella neurodegenerazione, nell’infiammazione e in fenotipi associati al cancro. In quanto “guardiano” del flusso di zinco, ZnT-1 è spesso studiato in modelli di stress da metalli, interazioni tra trasportatori e vie che collegano la disponibilità di micronutrienti alla regolazione genica.

ZnT-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC30A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ZnT-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC30A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC30A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ZnT-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC30A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ZnT-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ZnT-1 nelle cellule tumorali con espressione di SLC30A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.