Wnt-8b Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405077-ACT

WNT8B codifica la glicoproteina secreta Wnt-8b, un ligando della rete di segnalazione Wnt che regola la specificazione del destino cellulare, la proliferazione e il patterning dei tessuti. Wnt-8b influenza principalmente i programmi trascrizionali canonici Wnt/β-catenina interagendo con i co-recettori Frizzled e LRP, con effetti a valle sull’espressione dei geni dello sviluppo e sulle traiettorie di differenziamento. Nella biologia umana, l’attività di WNT8B è strettamente associata a processi di neurosviluppo e al patterning regionale del sistema nervoso centrale, e le alterazioni del tono della via Wnt sono spesso studiate nel contesto della segnalazione oncogenica e del controllo anomalo della crescita. La modulazione dell’espressione di WNT8B è quindi rilevante per analizzare il cross-talk tra vie, inclusa la trascrizione mediata da TCF/LEF, gli stati cellulari di tipo staminale e gli esiti di differenziamento dipendenti dal contesto.

Wnt-8b Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WNT8B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Wnt-8b Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WNT8B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WNT8B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Wnt-8b. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WNT8B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Wnt-8b nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Wnt-8b nelle cellule tumorali con espressione di WNT8B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.