Wee 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400701-ACT

WEE1 codifica la tirosin-chinasi nucleare Wee1, un regolatore centrale del checkpoint G2/M di risposta al danno al DNA, che limita l’attività di CDK1–ciclina B tramite fosforilazione inibitoria. Integrando i segnali provenienti dalle vie ATR/CHK1 e dallo stress replicativo, Wee1 coordina la progressione del ciclo cellulare con il completamento della replicazione del DNA e con i processi di riparazione, sostenendo la stabilità del genoma durante la fase S e la mitosi. Un’espressione o attività deregolata di WEE1 è frequentemente associata, in ambito oncologico, ad alterazioni del controllo dei checkpoint, alla tolleranza allo stress replicativo e all’instabilità cromosomica; inoltre viene studiata anche nel contesto delle risposte allo stress genotossico. Di conseguenza, WEE1 è comunemente oggetto di studio nei meccanismi di controllo del ciclo cellulare, nella segnalazione del danno al DNA e negli studi di interazioni sintetiche che coinvolgono lo stato di p53 e altri componenti dei checkpoint.

Wee 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WEE1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Wee 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WEE1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WEE1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Wee 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WEE1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Wee 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Wee 1 nelle cellule tumorali con espressione di WEE1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.