Wee 1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400701-ACT

WEE1 codifica a tirosina quinase nuclear Wee1, um regulador central do checkpoint de dano ao DNA na transição G2/M, que restringe a atividade do complexo CDK1–ciclina B por meio de fosforilação inibitória. Ao integrar sinais das vias ATR/CHK1 e de estresse replicativo, Wee1 coordena a progressão do ciclo celular com a conclusão da replicação e o reparo do DNA, sustentando a estabilidade genômica durante a fase S e a mitose. A expressão ou atividade desregulada de WEE1 é frequentemente associada a controle alterado de checkpoints, tolerância ao estresse replicativo e instabilidade cromossômica na biologia do câncer, e também é estudada em contextos de respostas a estresse genotóxico. Como resultado, WEE1 é comumente investigado em mecanismos de controle do ciclo celular, sinalização de dano ao DNA e estudos de interações sintéticas envolvendo o status de p53 e outros componentes de checkpoint.

Wee 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de WEE1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Wee 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus WEE1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição WEE1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Wee 1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus WEE1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Wee 1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Wee 1 em células tumorais com expressão de WEE1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.