V-ATPase G1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406125-ACT

ATP6V1G1 codifica la subunità G1 del dominio periferico V1 dell’H+-ATPasi vacuolare (V-ATPasi), una pompa protonica multisubunità che accoppia l’idrolisi dell’ATP all’acidificazione degli organelli. Il controllo del pH mediato dalla V-ATPasi è fondamentale per la maturazione endosoma–lisosoma, l’endocitosi mediata da recettore, il flusso autofagico e il traffico vescicolare, e influenza reti di segnalazione come mTORC1 attraverso il sensing lisosomiale dei nutrienti. Modulando l’acidità del lume, l’attività della V-ATPasi influisce sull’attivazione delle proteasi, sulla processazione degli antigeni e sulle dinamiche di fusione di membrana nei diversi compartimenti intracellulari. La disregolazione dell’omeostasi del pH degli organelli e lo squilibrio delle subunità della V-ATPasi sono stati associati ad alterazioni metaboliche, fenotipi invasivi e programmi di adattamento allo stress osservati in molteplici contesti cellulari rilevanti per la malattia.

V-ATPase G1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATP6V1G1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

V-ATPase G1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATP6V1G1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATP6V1G1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di V-ATPase G1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATP6V1G1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da V-ATPase G1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via V-ATPase G1 nelle cellule tumorali con espressione di ATP6V1G1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.