V-ATPase A2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406000-ACT

ATP6V0A2 codifica l’isoforma a2 della sottounità a del dominio V0 della H+-ATPasi vacuolare (V-ATPase), una pompa protonica multisubunità che acidifica endosomi, lisosomi e compartimenti secretori. Regolando il pH degli organelli, la V-ATPase A2 sostiene l’endocitosi mediata da recettore, il traffico vescicolare, la maturazione delle proteine e le vie di degradazione dipendenti dai lisosomi che influenzano l’omeostasi cellulare. L’attività di ATP6V0A2 incide anche sull’assemblaggio della matrice extracellulare e su processi secretori associati alla glicosilazione, collegando l’acidificazione dei compartimenti all’organizzazione dei tessuti. Alterazioni o deregolazione di ATP6V0A2 sono state associate a disturbi congeniti che compromettono l’integrità del tessuto connettivo e la glicosilazione, rendendolo rilevante per gli studi sul controllo del pH intracellulare e sulla biologia della via secretoria.

V-ATPase A2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATP6V0A2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

V-ATPase A2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATP6V0A2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATP6V0A2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di V-ATPase A2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATP6V0A2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da V-ATPase A2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via V-ATPase A2 nelle cellule tumorali con espressione di ATP6V0A2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.