USP15 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402416-ACT

USP15 codifica una proteasi specifica per l’ubiquitina che rimuove le catene di ubiquitina dalle proteine bersaglio per regolarne stabilità, localizzazione e output di segnalazione all’interno del sistema ubiquitina–proteasoma. Nell’uomo, USP15 è stata implicata nella modulazione della segnalazione TGF-β/SMAD, delle vie dell’immunità innata e antivirali e delle risposte allo stress, attraverso la regolazione dell’ubiquitinazione di componenti delle vie e di proteine adattatrici. Tramite questi ruoli, USP15 contribuisce al controllo della progressione del ciclo cellulare, delle risposte al danno al DNA e di programmi trascrizionali legati alla differenziazione e alla plasticità cellulare. Un’attività o un’espressione deregolata di USP15 è stata associata a contesti di segnalazione oncogenica e a fenotipi correlati al sistema immunitario, rendendola rilevante per studi meccanicistici sul crosstalk tra vie di segnalazione e sulla proteostasi.

USP15 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di USP15 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

USP15 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus USP15 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione USP15, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di USP15. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus USP15 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da USP15 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via USP15 nelle cellule tumorali con espressione di USP15 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.