URB Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408597-ACT

CCDC80 codifica URB, una proteina secreta e associata alla matrice extracellulare, implicata nel rimodellamento dello stroma, nell’adesione cellula–matrice e nella regolazione della segnalazione dei fattori di crescita. URB è stata collegata a vie che influenzano l’adipogenesi, l’omeostasi metabolica e il controllo, dipendente dal contesto, della proliferazione e migrazione cellulare, coerentemente con un ruolo nell’organizzazione tissutale e nel dialogo mesenchima–epitelio. Alterazioni dell’espressione di CCDC80 sono state riportate in molteplici contesti patologici, inclusi fenotipi associati all’obesità e tumori, nei quali possono correlare con cambiamenti nella composizione del microambiente tumorale e nel comportamento invasivo. Queste caratteristiche rendono CCDC80 un bersaglio utile per analizzare le reti di segnalazione extracellulare, la biologia della matrice e i programmi trascrizionali associati a cambiamenti di stato fenotipico.

URB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCDC80 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

URB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCDC80 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCDC80, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di URB. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCDC80 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da URB nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via URB nelle cellule tumorali con espressione di CCDC80 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.