UPIb Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404274-ACT

UPK1B codifica l’uroplachina-1B (UPIb), una proteina integrale di membrana simile alle tetraspanine che si assembla con altre uroplachine per formare le placche uroteliali sulla superficie apicale delle cellule a ombrello. Queste placche contribuiscono all’integrità della barriera epiteliale, all’organizzazione della membrana e agli eventi di traffico vescicolare che regolano il rimodellamento della superficie nel tratto urinario. L’espressione di UPK1B è fortemente arricchita nell’urotelio differenziato ed è comunemente utilizzata come marcatore della linea uroteliale e dei programmi di differenziazione epiteliale. Alterazioni dei pattern di espressione delle uroplachine sono state riportate in patologie uroteliali e vengono studiate nel contesto dell’omeostasi dell’epitelio vescicale, della metaplasia e dei cambiamenti dello stato di differenziazione associati ai tumori.

UPIb Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UPK1B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UPIb Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UPK1B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UPK1B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UPIb. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UPK1B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UPIb nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UPIb nelle cellule tumorali con espressione di UPK1B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.