UGT1A1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401190-ACT

UGT1A1 codifica una UDP‑glucuronosiltransferasi microsomiale che catalizza la glucuronidazione della bilirubina e di diversi composti endogeni lipofili, aumentandone la solubilità per l’escrezione biliare. Questo enzima di coniugazione di fase II opera nelle reti di detossificazione epatiche ed extraepatiche e interagisce con la segnalazione di risposta agli xenobiotici che regola metabolismo e clearance. Le varianti o la ridotta espressione di UGT1A1 sono associate a una coniugazione compromessa della bilirubina e a fenotipi di iperbilirubinemia; inoltre, l’attività di UGT1A1 è un determinante chiave della gestione metabolica di molte piccole molecole. Di conseguenza, UGT1A1 è ampiamente utilizzato per studiare la regolazione della capacità di glucuronidazione, l’omeostasi metabolica epatica e le differenze interindividuali nelle vie di coniugazione.

UGT1A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UGT1A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UGT1A1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UGT1A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UGT1A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UGT1A1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UGT1A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UGT1A1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UGT1A1 nelle cellule tumorali con espressione di UGT1A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.