TRPM4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402176-ACT

TRPM4 codifica un canale cationico monovalente attivato dal Ca2+ che conduce Na+ e K+ depolarizzando la membrana plasmatica senza trasportare direttamente Ca2+. Modellando il potenziale di membrana, TRPM4 modula l’ingresso di Ca2+ attraverso canali operati dallo svuotamento delle riserve (store-operated) e influenza la segnalazione a valle dipendente dal Ca2+, inclusi NFAT e altri programmi trascrizionali che controllano eccitabilità, secrezione e motilità cellulare. L’attività di TRPM4 è stata collegata alla regolazione della conduzione cardiaca e del tono vascolare e contribuisce all’attivazione delle cellule immunitarie e alla segnalazione infiammatoria nelle popolazioni mieloidi e linfoidi. Un’espressione o una funzione del canale TRPM4 deregolate sono associate a meccanismi aritmogenici, risposte neuroinfiammatorie e fenotipi proliferativi alterati rilevanti per studi in oncologia e nel rimodellamento tissutale.

TRPM4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRPM4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRPM4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRPM4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRPM4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRPM4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRPM4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRPM4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRPM4 nelle cellule tumorali con espressione di TRPM4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.