Troponin T-FS Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402885-ACT

TNNT3 codifica la troponina T del muscolo scheletrico a contrazione rapida (Troponina T-FS), un componente fondamentale del complesso della troponina che ancora la tropomiosina al filamento sottile e collega il legame del Ca²⁺ al ciclo regolato dei ponti trasversali actina–miosina. Integrando la segnalazione del calcio con la meccanica del sarcomero, la Troponina T-FS contribuisce a determinare la cinetica di contrazione, la generazione di forza e le proprietà contrattili specifiche del tipo di fibra. L’attività di TNNT3 si intreccia con i percorsi dell’accoppiamento eccitazione–contrazione e dell’assemblaggio miofibrillare che modellano le prestazioni muscolari e l’integrità strutturale. La disregolazione o le varianti nei componenti della troponina rapida sono state associate ad alterazioni della contrattilità e a fenotipi miopatici, rendendo TNNT3 un nodo utile per studiare la biologia del muscolo scheletrico e il rimodellamento contrattile rilevante per la malattia.

Troponin T-FS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TNNT3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Troponin T-FS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TNNT3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TNNT3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Troponin T-FS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TNNT3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Troponin T-FS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Troponin T-FS nelle cellule tumorali con espressione di TNNT3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.