Tropomyosin γ Particelle di Attivazione Lentivirale (m2): sc-425595-LAC-2

Nel topo, Tpm3 codifica la tropomiosina γ, una proteina a coiled-coil legante l’actina che polimerizza lungo l’actina filamentosa per regolare la stabilità dei filamenti sottili, l’accesso della miosina e la generazione di forza nelle strutture citoscheletriche e contrattili. Definendo l’identità e la dinamica dei filamenti di actina, TPM3 contribuisce a processi quali il controllo della forma cellulare, l’adesione, la migrazione e la meccanotrasduzione, influenzando il rimodellamento actomiosinico in cellule muscolari e non muscolari. Un’alterazione della funzione o dell’espressione di TPM3 è stata associata a difetti del citoscheletro e a miopatie, e eventi di fusione di TPM3 sono implicati in contesti di segnalazione oncogenica che modificano comportamenti dipendenti dall’actina. La perturbazione genetica di Tpm3 in modelli murini supporta studi meccanicistici sulla regolazione actina–miosina, sull’assemblaggio del sarcomero e sulle interazioni tra vie citoscheletriche, tramite editing basato su CRISPR e fenotipizzazione funzionale.

Le particelle di attivazione lentivirale Tropomyosin γ (m2) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Tpm3 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Tropomyosin γ (m2) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Tpm3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Tropomyosin γ. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Tpm3 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.