Trio Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401231-ACT

Il TRIO umano codifica Trio, un fattore di scambio di nucleotidi della guanina (GEF) per le Rho, a domini multipli, che attiva GTPasi della famiglia Rho, tra cui RAC1 e RHOA, per coordinare il rimodellamento del citoscheletro di actina, la polarità cellulare, l’adesione e la migrazione direzionale. Attraverso le sue funzioni di GEF e di scaffold, Trio integra segnali provenienti da recettori tirosin-chinasici, cue di guida e vie delle integrine, plasmando la crescita dei neuriti, lo sviluppo delle sinapsi e il traffico vescicolare. La segnalazione dipendente da TRIO modula processi collegati a MAPK e PI3K e influenza programmi trascrizionali a valle della dinamica del citoscheletro. Un’attività di TRIO deregolata e un controllo alterato delle Rho GTPasi sono stati implicati in fenotipi neuroevolutivi e in comportamenti cellulari rilevanti per l’invasione tumorale e il potenziale metastatico, a supporto di studi meccanicistici sulla motilità e sulla formazione dei circuiti neurali.

Trio Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRIO senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Trio Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRIO nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRIO, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Trio. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRIO nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Trio nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Trio nelle cellule tumorali con espressione di TRIO silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.