TRC8 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-429220-ACT

Rnf139 codifica TRC8, una ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo RING finger residente nel reticolo endoplasmatico, implicata nel turnover proteico dipendente dall’ubiquitina e nella degradazione associata al RE (ERAD). Accoppiando l’ubiquitinazione alla rimozione mediata dal proteasoma, TRC8 contribuisce alla proteostasi e può influenzare processi regolati da lipidi e steroli tramite interazioni con regolatori di segnalazione e metabolici associati alla membrana. Alterazioni dell’attività di TRC8 sono state collegate a una deregolazione del controllo della crescita e delle risposte allo stress cellulare, rendendo Rnf139 un nodo utile per studiare la segnalazione dell’ubiquitina in vie rilevanti per la stabilità del genoma, l’omeostasi metabolica e la trasformazione oncogenica. Nei modelli murini, la modulazione dell’espressione di Rnf139 supporta studi meccanicistici sulla proteostasi specifica di tessuto e sul rimodellamento delle reti di segnalazione.

TRC8 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Rnf139 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRC8 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Rnf139 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Rnf139, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRC8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Rnf139 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRC8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRC8 nelle cellule tumorali con espressione di Rnf139 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.