TRADD Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401177-ACT

La TRADD umana (TNFRSF1A-associated via death domain) è una proteina adattatrice che collega il recettore TNF 1 attivato a complessi di segnalazione a valle che controllano la trascrizione infiammatoria e le decisioni sul destino cellulare. Attraverso interazioni mediate dal suo death domain, TRADD partecipa all’assemblaggio di complessi prossimali al recettore che regolano le vie canoniche di NF-κB e MAPK, e può anche influenzare la segnalazione apoptotica dipendente dalle caspasi a seconda del contesto cellulare. La segnalazione mediata da TRADD modella le risposte immunitarie innate, la produzione di citochine e le risposte allo stress, rendendola rilevante per studi su infiammazione cronica, disregolazione immunitaria e meccanismi di sopravvivenza delle cellule tumorali. Un’alterata attività dell’asse TNF/TRADD è stata implicata in diversi fenotipi associati a malattia, nei quali risultano perturbate la trascrizione guidata da NF-κB e la segnalazione dei recettori di morte.

TRADD Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRADD senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRADD Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRADD nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRADD, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRADD. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRADD nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRADD nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRADD nelle cellule tumorali con espressione di TRADD silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.