TRABID Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402852-ACT

Lo ZRANB1 umano codifica TRABID, una deubiquitinasi della famiglia OTU che scinde preferenzialmente catene di poliubiquitina legate tramite K29 e K33, rimodellando la segnalazione dipendente dall’ubiquitina. TRABID è stato implicato nella regolazione dei programmi trascrizionali di Wnt/β-catenina e della segnalazione infiammatoria associata a NF-κB attraverso la modulazione di componenti ubiquitinati delle vie di segnalazione, influenzando l’espressione genica e l’omeostasi cellulare. Modificando la topologia delle catene di ubiquitina, TRABID contribuisce al controllo della stabilità proteica e della propagazione del segnale in contesti quali proliferazione, differenziamento e risposte allo stress. La disregolazione di queste vie collega i meccanismi correlati a TRABID alla biologia del cancro, ad alterazioni della segnalazione immunitaria e ad altri fenotipi cellulari rilevanti per la malattia, investigabili in sistemi modello.

TRABID Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ZRANB1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRABID Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ZRANB1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ZRANB1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRABID. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ZRANB1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRABID nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRABID nelle cellule tumorali con espressione di ZRANB1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.