TPR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402928-ACT

Il TPR umano codifica una grande nucleoporina a coiled-coil che costituisce un’impalcatura chiave del cestello del poro nucleare, sostenendo il trasporto nucleo–citoplasmatico e l’organizzazione nucleare di ordine superiore. TPR contribuisce all’esportazione e alla sorveglianza dell’mRNA, interagisce con il checkpoint del fuso durante la mitosi e aiuta a mantenere la stabilità del genoma coordinando processi associati all’involucro nucleare. In virtù di questi ruoli, un’alterata regolazione di TPR o eventi di fusione sono stati collegati a segnalazione deregolata e a riarrangiamenti cromosomici osservati in diversi contesti tumorali, rendendolo rilevante per studi sui programmi trascrizionali oncogenici e sul controllo del ciclo cellulare. La funzione di TPR è inoltre spesso esaminata nelle vie che regolano il processamento dell’RNA, la fedeltà mitotica e il traffico nucleare responsivo allo stress.

TPR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TPR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TPR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TPR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TPR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TPR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TPR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TPR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TPR nelle cellule tumorali con espressione di TPR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.