Topo IIIα Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404439-ACT

TOP3A codifica per la DNA topoisomerasi IIIα, una topoisomerasi di tipo IA che risolve lo stress topologico del DNA e gli intermedi della ricombinazione durante la replicazione e la riparazione. La Topo IIIα agisce insieme all’elicasi BLM, a RMI1 e a RMI2 nel complesso BTRR per dissolvere le doppie giunzioni di Holliday e sopprimere eventi di crossing-over aberranti, promuovendo così la stabilità del genoma. Attraverso i suoi ruoli nella ricombinazione omologa, nel riavvio delle forcelle di replicazione e nella decatenazione del DNA intrecciato, TOP3A contribuisce a mantenere una corretta segregazione cromosomica e la manutenzione del DNA mitocondriale. L’alterazione di questa rete è associata a un aumento degli scambi tra cromatidi fratelli e a fenotipi di instabilità genomica rilevanti per la biologia del cancro e per disordini ereditari della manutenzione del genoma.

Topo IIIα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TOP3A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Topo IIIα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TOP3A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TOP3A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Topo IIIα. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TOP3A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Topo IIIα nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Topo IIIα nelle cellule tumorali con espressione di TOP3A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.