TMEM106B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404348-ACT

TMEM106B codifica una proteina transmembrana lisosomiale coinvolta nel traffico endolisosomiale, nella dimensione e nell’acidificazione dei lisosomi e nel mantenimento della proteostasi cellulare. Interagisce con vie che controllano la maturazione delle vescicole e la funzione dell’asse autofagia–lisosoma, influenzando il turnover delle proteine di membrana e dei carichi aggregati nel sistema endosomiale. Studi genetici e di espressione hanno associato TMEM106B alla suscettibilità alle malattie neurodegenerative e a fenotipi di disfunzione lisosomiale, inclusa la modulazione del rischio di demenza frontotemporale. Di conseguenza, TMEM106B è spesso studiato in modelli neuronali e gliali per indagare meccanismi centrati sul lisosoma che regolano la rimozione delle proteine, le risposte allo stress e la sopravvivenza cellulare.

TMEM106B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TMEM106B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TMEM106B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TMEM106B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TMEM106B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TMEM106B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TMEM106B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TMEM106B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TMEM106B nelle cellule tumorali con espressione di TMEM106B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.