TIMP-2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423403-ACT

Il gene murino Timp2 codifica l’inibitore tissutale delle metalloproteinasi-2 (TIMP-2), una glicoproteina secreta che modula il turnover della matrice extracellulare (ECM) inibendo le metalloproteinasi della matrice e regolando la proteolisi pericellulare. Oltre alla sua ampia azione inibitoria sulle MMP, TIMP-2 partecipa a complessi regolatori di MMP2 e influenza l’adesione e la migrazione cellulare, nonché il rimodellamento tissutale, attraverso la segnalazione ECM–integrine e la disponibilità di fattori di crescita. Questi processi sono centrali nell’angiogenesi, nella fibrosi e nel rimodellamento infiammatorio, rendendo Timp2 un nodo frequentemente studiato in modelli di riparazione delle ferite e di disregolazione della matrice specifica d’organo. Un’attività alterata di TIMP-2 è comunemente associata, negli studi di biologia del cancro, a cambiamenti del potenziale invasivo e alla formazione della nicchia metastatica, senza che ciò implichi esiti clinici.

TIMP-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Timp2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TIMP-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Timp2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Timp2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TIMP-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Timp2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TIMP-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TIMP-2 nelle cellule tumorali con espressione di Timp2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.