TIM-3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-431363-ACT

Il gene Havcr2 del topo codifica la proteina 3 contenente domini immunoglobulinici e mucinici delle cellule T (TIM-3), un recettore checkpoint immunitario espresso sulle cellule T attivate, sulle cellule T regolatorie e su sottopopolazioni dell’immunità innata, incluse cellule dendritiche e macrofagi. TIM-3 integra segnali provenienti da ligandi come galectina-9 e fosfatidilserina per modulare l’attivazione guidata dal recettore delle cellule T, la produzione di citochine e i programmi di tolleranza immunitaria. Attraverso il crosstalk con vie inibitorie e reti di presentazione dell’antigene, TIM-3 contribuisce alla regolazione della differenziazione effettrice e di caratteristiche associate alla disfunzione delle cellule T durante un’esposizione antigenica persistente. Una segnalazione Havcr2/TIM-3 disregolata è stata collegata a fenotipi infiammatori e autoimmuni in modelli preclinici ed è ampiamente studiata nel contesto dell’immunosoppressione associata ai tumori e della biologia delle infezioni croniche.

TIM-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Havcr2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TIM-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Havcr2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Havcr2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TIM-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Havcr2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TIM-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TIM-3 nelle cellule tumorali con espressione di Havcr2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.