TIF1β Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401999-ACT

TRIM28, noto anche come TIF1β (KAP1), è un corepressore trascrizionale associato ai KRAB che coordina il silenziamento genico epigenetico reclutando modificatori della cromatina come SETDB1 e il complesso NuRD/HDAC per stabilire eterocromatina marcata da H3K9me3. Svolge ruoli centrali nella regolazione degli elementi trasponibili, nella stabilità genomica, nelle risposte al danno del DNA e nel mantenimento dell’identità cellulare attraverso un ampio controllo dei programmi trascrizionali. La repressione dipendente da TRIM28 si integra con vie che controllano l’organizzazione della cromatina, la segnalazione mediata dall’ubiquitina e le reti trascrizionali dello sviluppo. La disregolazione dell’attività di TRIM28/TIF1β è stata associata ad alterati stati di differenziamento e a una repressione trascrizionale aberrante osservata in molteplici contesti rilevanti per la malattia, inclusi il rimodellamento epigenetico oncogenico e fenotipi del neurosviluppo.

TIF1β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRIM28 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TIF1β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRIM28 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRIM28, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TIF1β. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRIM28 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TIF1β nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TIF1β nelle cellule tumorali con espressione di TRIM28 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.