TFEB Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-437332-ACT

Mouse Tfeb codifica il fattore di trascrizione EB (TFEB), un regolatore basic helix–loop–helix con leucine zipper che coordina la biogenesi lisosomiale e l’autofagia attraverso la rete genica CLEAR. TFEB integra segnali di nutrienti e di stress a valle di mTORC1 e di vie chinasiche correlate per controllare la funzione dei lisosomi, il traffico endolisosomiale e la proteostasi cellulare. Alterazioni dell’attività di TFEB sono state collegate a una disregolazione delle vie autofagia–lisosoma implicate nella neurodegenerazione, nella disfunzione metabolica e in fenotipi simili alle malattie da accumulo lisosomiale, rendendolo un nodo chiave per studi meccanicistici dei programmi cellulari di “clearance”.

TFEB Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Tfeb senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TFEB Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Tfeb nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Tfeb, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TFEB. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Tfeb nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TFEB nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TFEB nelle cellule tumorali con espressione di Tfeb silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.