TET1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400845-ACT

La TET1 umana (ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1) è una diossigenasi dipendente da Fe(II)/2-ossoglutarato che catalizza l’ossidazione della 5-metilcitosina a 5-idrossimetilcitosina e a ulteriori derivati ossidati, avviando la demetilazione attiva del DNA. Attraverso questa attività, TET1 modella la regolazione epigenetica della trascrizione, lo stato della cromatina e i programmi genici dello sviluppo, influenzando processi quali la specificazione del destino cellulare, la stabilità del genoma e le risposte al danno al DNA. Il rimodellamento dei pattern di metilazione del DNA dipendente da TET1 si integra con reti trascrizionali e modificatori della cromatina per controllare l’attività di enhancer e promotori. Un’espressione deregolata di TET1 o paesaggi di 5hmC alterati sono stati associati a stati trascrizionali aberranti nel cancro e ad alterazioni epigenetiche rilevanti per il neurosviluppo e la regolazione immunitaria, rendendola un bersaglio chiave per studi meccanicistici dei fenotipi guidati dall’epigenoma.

TET1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TET1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TET1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TET1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TET1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TET1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TET1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TET1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TET1 nelle cellule tumorali con espressione di TET1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.