TERT Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423341-ACT

Il gene Tert del topo codifica la telomerasi reverse transcriptase (TERT), il nucleo catalitico della ribonucleoproteina telomerasica che estende le ripetizioni di DNA telomerico per preservare l’integrità delle estremità cromosomiche. Contrastando l’accorciamento dei telomeri durante la replicazione del DNA, TERT sostiene la durata replicativa, la stabilità del genoma e la progressione del ciclo cellulare, intersecandosi con la segnalazione della risposta al danno del DNA e con i programmi di senescenza. La regolazione di Tert è centrale per l’omeostasi delle cellule staminali e progenitrici ed è spesso alterata in contesti caratterizzati da disfunzione telomerica, inclusi fenotipi di invecchiamento precoce e modelli di tumorigenesi in cui il mantenimento dei telomeri influenza l’immortalità cellulare. La modulazione dell’espressione di Tert viene quindi impiegata per studiare la biologia dei telomeri, il controllo cromatinico e trascrizionale al locus Tert e l’attivazione di checkpoint indotti da stress.

TERT Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Tert senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TERT Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Tert nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Tert, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TERT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Tert nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TERT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TERT nelle cellule tumorali con espressione di Tert silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.