TEF-1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423326-ACT

Il gene murino Tead1 codifica il fattore di trascrizione TEF-1, una proteina di legame al DNA con dominio TEA/ATTS che coopera con i coattivatori YAP/TAZ per regolare l’attività degli enhancer e i programmi di espressione genica che controllano proliferazione, sopravvivenza e specificazione di linea. TEF-1 è un effettore centrale della via di segnalazione Hippo e integra segnali meccanici, contatto cellula-cellula e segnali della matrice extracellulare per modellare la crescita dei tessuti e la dimensione degli organi. Durante lo sviluppo e nell’omeostasi dell’adulto, TEF-1 influenza le reti geniche dei cardiomiociti e del muscolo scheletrico, così come la rigenerazione epiteliale e gli stati di cellule staminali/progenitrici. La trascrizione dipendente da TEAD deregolata è spesso studiata in contesti di controllo anomalo della crescita e di programmi trascrizionali fibrotici o oncogeni, rendendo Tead1 un nodo utile per interrogare la via in modelli murini.

TEF-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Tead1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TEF-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Tead1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Tead1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TEF-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Tead1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TEF-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TEF-1 nelle cellule tumorali con espressione di Tead1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.