TAZ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400320-ACT

WWTR1 codifica il co-attivatore trascrizionale TAZ (TAFAZ), un effettore centrale della via di segnalazione Hippo che collega il contatto cellula-cellula, gli stimoli meccanici e la polarità a programmi trascrizionali che controllano proliferazione, differenziamento e crescita tissutale. Quando le chinasi Hippo sono inattive, TAZ si accumula nel nucleo e coopera con i fattori di trascrizione della famiglia TEAD per regolare geni coinvolti nel rimodellamento della matrice extracellulare, nella plasticità epitelio-mesenchimale e in stati cellulari di tipo staminale. Un’attività aberrante di WWTR1/TAZ è associata a una meccanotrasduzione disregolata e a un’alterata specificazione di linea in molteplici contesti patologici, inclusi programmi trascrizionali associati al cancro e rimodellamento fibrotico. Queste caratteristiche rendono TAZ un nodo ampiamente utilizzato per studiare gli output YAP/TAZ–TEAD, il crosstalk con la segnalazione Wnt e TGF-β e il controllo trascrizionale dipendente dal contesto.

TAZ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WWTR1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TAZ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WWTR1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WWTR1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TAZ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WWTR1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TAZ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TAZ nelle cellule tumorali con espressione di WWTR1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.