Talin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401342-ACT

Il gene umano TLN1 codifica per la talina, un adattatore del citoscheletro che collega le code citoplasmatiche delle β-integrine alla F-actina, favorendo l’attivazione delle integrine, l’assemblaggio delle adesioni focali e la meccanotrasduzione. In coordinamento con la focal adhesion kinase (FAK), la segnalazione della famiglia Src, il rimodellamento dell’actina dipendente dalle GTPasi Rho e le vie PI3K–AKT, la talina contribuisce a regolare adesione, spreading, migrazione e sopravvivenza cellulare in risposta ai segnali della matrice extracellulare. Un’espressione alterata di TLN1 o dinamiche di adesione dipendenti dalla talina sono state associate a un’invasione disregolata e a un comportamento metastatico, nonché a difetti dell’emostasi e del trafficking delle cellule immunitarie, processi che dipendono dalla segnalazione mediata dalle integrine. Queste proprietà rendono TLN1 un bersaglio ampiamente utilizzato per studiare le reti di segnalazione dipendenti dall’adesione e le interazioni cellula–matrice sensibili alle forze.

Talin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TLN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Talin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TLN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TLN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Talin-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TLN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Talin-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Talin-1 nelle cellule tumorali con espressione di TLN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.